基于反射式成像光路的全波段蛋白檢測儀的研制

張亞兵，戴 博

（上海理工大學 光電信息與計算機工程學院，上海 200093）

引 言

酶標儀又名酶聯(lián)免疫檢測儀，是對酶聯(lián)免疫吸附實驗結(jié)果進行讀取和分析的專業(yè)醫(yī)學儀器。免疫蛋白檢測包括酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）、二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid assay，BCA）、蛋白質(zhì)濃度測定實驗等[1-2], 是近些年來普遍應(yīng)用于心血管疾病[3]等早期疾病診斷的以蛋白質(zhì)作為生物標志物的檢測方法[4-5]。酶聯(lián)免疫反應(yīng)通過結(jié)合在抗原或抗體上的酶催化顯色底物發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果以顏色的深淺進行顯示，溶液顏色的深淺值對應(yīng)吸光度值的大小，以此來判斷溶液樣本中待測抗體或者待測抗原的濃度[6]。酶標儀廣泛應(yīng)用在臨床檢驗、生物學研究、農(nóng)業(yè)科學、食品和環(huán)境科學等領(lǐng)域。ELISA是一種定性和定量的檢測方法，其中檢測機制為可溶性的抗原或抗體會因為抗原和抗體結(jié)合的專一性發(fā)生免疫反應(yīng)，而抗體或抗原會先與聚苯乙烯等固相載體結(jié)合。BCA蛋白濃度檢測實驗則是基于溶液顏色深淺相對應(yīng)的吸光度值來計算溶液中蛋白質(zhì)的濃度[7]。酶標儀本質(zhì)上是一臺簡單的光電比色計，工作原理和酶標儀一樣都是由濾光片或單色器將光源發(fā)出的光轉(zhuǎn)換成一束單色光，該單色光進入酶標板微孔板中的待測樣本中，由于待測樣本為溶液，會吸收一部分單色光，而其他的光會透過待檢測溶液，經(jīng)過不同濃度微孔板中的溶液后，光電檢測器將不同微孔板中的不同強度的光信號進行光電轉(zhuǎn)換，通過上位機進行數(shù)據(jù)處理和計算得到實驗結(jié)果。酶標儀通過衍射光柵或濾光片選擇不同波長的光與待測溶液的吸光度相對應(yīng)的某一波長的光，使用由電機控制的光電探測元件來逐一掃描酶標板上的微孔[8-9]。傳統(tǒng)酶標儀光學系統(tǒng)笨重且復雜，加上機器內(nèi)部的機電轉(zhuǎn)換裝置，導致儀器的體積大，成本高，檢測效率低，衍射光柵或濾光片價格昂貴[10]，且只有專業(yè)的人員才能完成精密儀器的操作和實驗結(jié)果的分析。

本文研制了基于反射式成像光路的全波段蛋白檢測儀，分別進行了PTX3酶聯(lián)免疫吸附實驗和BCA蛋白濃度檢測實驗，兩個實驗具有不同的檢測波長，實驗中使用超廣角鏡頭捕獲到實驗的待測樣本圖片后，使用基于圖像處理的比色算法對圖片進行處理與分析，能夠快速準確地實現(xiàn)380～750 nm波段蛋白濃度的檢測，同時降低了儀器使用濾光片或光柵的昂貴成本，通過與商用酶標儀的檢測結(jié)果進行對比，驗證了全波段蛋白檢測儀的可行性。

1 基于反射式成像光路的全波段蛋白檢測儀

1.1 硬件系統(tǒng)

圖1（a）、（b）分別為全波段蛋白檢測儀的外部結(jié)構(gòu)圖和內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖。儀器的檢測機制為將含有樣本的酶標板放入全波段蛋白檢測儀中，打開LED光源，光透射經(jīng)過樣本，一部分被溶液吸收，另一部分光經(jīng)反射鏡改變光路，由廣角鏡頭和CCD捕獲。CCD將光信號轉(zhuǎn)換為電信號，傳輸至上位機，上位機進行數(shù)據(jù)圖像處理，將圖片中的溶液顏色信息轉(zhuǎn)換為待檢測樣本的蛋白濃度信息。

圖1 全波段蛋白檢測儀的內(nèi)外部結(jié)構(gòu)Fig. 1 Internal and external structure of a full band protein detector

光學成像系統(tǒng)包括LED光源、勻光板、前表面鍍膜反射鏡、超廣角鏡頭、CCD。LED光源是由96個LED燈組成，且與酶標板的96微孔一一對應(yīng)，LED燈的光譜可以全面覆蓋380～750 nm的可見光范圍，峰值波長為481 nm，LED光源通過勻光板使光強更加均勻、穩(wěn)定，勻光板采用雙面磨砂1.2 mm厚度，透射率為90%，透射霧度為98%。反射鏡采用前表面鍍膜技術(shù)，保護膜的厚度為250 nm，反射率為99.67%，采用焦距為12 mm，視場角為100°的鏡頭。在成像系統(tǒng)中，為了提高成像的視場范圍，往往會造成較大的光程，從而造成較低的空間利用率。全波段蛋白檢測儀采用反射式光學檢測的方式進行成像[11]，將一維成像光程擴展為二維，提高維度減少空間，同時提高視場范圍，光程從原來100 cm減小到60 cm，使系統(tǒng)更加緊湊，架構(gòu)更穩(wěn)定，成像系統(tǒng)的光路模擬圖如圖2所示。

圖2 成像系統(tǒng)光路模擬圖Fig. 2 Optical path simulation of the imaging system

電路系統(tǒng)是由USB HUB、GPIO （generalpurpose input/output）控制器、繼電器和電源組成。電路系統(tǒng)控制光源和成像系統(tǒng)，并通過上位機軟件進行操控，實現(xiàn)點亮光源、攝像機拍照的功能，以獲取酶標板微孔板中樣本溶液顏色信息圖來進行后續(xù)的數(shù)據(jù)圖像處理功能。機械部分是由外殼、底座、酶標板安裝架、鏡面支撐架、相機固定架構(gòu)成。儀器外殼采用3D打印技術(shù)使用環(huán)氧樹脂材料，其他部分均使用鋁合金材質(zhì)。酶標板固定架通過伸縮彈簧和限位螺絲保證酶標板的放入彈出以及位置的固定。

1.2 軟件算法

全波段蛋白檢測儀獲取到檢測樣本圖片后，將圖片傳輸至上位機，上位機將獲取的圖片轉(zhuǎn)換為歸一化的RGB顏色空間，減少光照強度對成像的影響。Human Pentraxin 3/TSG-14酶聯(lián)免疫吸附實驗完成后溶液顏色為藍色，加入終止液后變?yōu)辄S色，光的吸收檢測波長為450 nm，所以選擇藍色通道來對顯色溶液后的圖片通過基于圖像處理的比色算法來獲取圖片中溶液的質(zhì)量濃度信息。BCA蛋白濃度檢測實驗的溶液顏色為紫色，溶液對應(yīng)的光吸收度的檢測波長為562 nm，因此選擇歸一化的綠色通道分析[12-13]。

PC端的程序是由Visual Studio 2019軟件來實現(xiàn)的，程序的功能包括對全波段蛋白檢測儀的光源以及成像模塊的控制以及OD （Optical Density）值、濃度信息的獲取及界面顯示。圖像處理比色算法流程如圖3所示，首先，獲取酶標板中96孔微孔板的中心，并求得每個微孔的像素均值，由于每個微孔加入的樣本體積是一致的，因此以中心區(qū)域的像素均值作為樣本濃度的指標。微孔板中的像素取值范圍為0～255，使用微孔的像素均值作為標準曲線的縱坐標，以待測樣本濃度作為橫坐標使用基于四參數(shù)擬合模型來繪制標準曲線，并由標準曲線來分析未知樣本的濃度信息。

圖3 圖像處理比色算法Fig. 3 Colorimetric algorithm

2 實驗與驗證

2.1 試劑與儀器

實驗中所用的試劑及儀器包括：Human Pentraxin 3/TSG-14檢測試劑盒（產(chǎn)品編號DPTX35）；Pierce? BCA蛋白質(zhì)量濃度測定試劑盒（Thermo Fisher，產(chǎn)品編23225）; 稀釋液（PBST，Thermo Fisher）；基于反射式成像光路的全波段蛋白檢測儀；移液槍（Eppendorf AG）；Infinite M200 商用酶標儀（Tecan）；超純水機（上海和泰公司）；TRIO TM-2N振蕩器（ASONE）。

2.2 PTX3酶聯(lián)免疫吸附實驗

先用移液槍向96孔酶標板的每個微孔中加入200 μL一抗，在20 ℃的室溫下，將裝有待測樣本的酶標板放入振蕩器中培養(yǎng)60 min。培養(yǎng)60 min后，向微孔中加入400 μL的PBST重復洗滌微孔2次，洗滌完成后，移出多余的PBST，并將酶標板翻轉(zhuǎn)，將殘留的PBST拍出，然后向需要的微孔中加入100 μL的測定稀釋劑RD-156和20 μL 的待測樣本，使用試劑盒中的透明封板紙密封酶標板，在室溫下培養(yǎng)2 h。培養(yǎng)完成后使用PBST重復洗滌微孔4次，向相應(yīng)的微孔中加入200 μL酶標檢測抗體，室溫下培養(yǎng)2 h。孵育完后將微孔洗滌4次，并將酶標板翻轉(zhuǎn)，將殘留的PBST拍出，向酶標板的每個微孔中加入200 μL結(jié)合液，并將酶標板放在避光20 ℃的環(huán)境下培養(yǎng)30 min。最后，向?qū)?yīng)的微孔中加入50 μL終止液，在15 min內(nèi)測量反應(yīng)產(chǎn)物。PTX3酶聯(lián)免疫吸附實驗按照試劑盒說明書中的實驗步驟進行操作。實驗采用96孔透明酶標板，制作兩列相同濃度的標準品，每列設(shè)置8個標準品，兩列標準品質(zhì)量濃度遞減，質(zhì)量濃度范圍為0～20 ng/mL；并檢測16個未知樣本中的PTX3蛋白濃度，實驗完成后采集的圖像如圖4所示。

圖4 PTX3實驗圖像Fig. 4 PTX3 experimental result

2.3 BCA蛋白濃度測定實驗

使用96孔酶標板進行BCA蛋白測定實驗，實驗中做出兩列濃度相同的標準品，其中包含2個空白對照孔。BCA蛋白濃度實驗中檢測40份未知樣本的蛋白濃度。按照試劑盒中的說明書中的表格進行標準品的稀釋，并依次稀釋出一組有質(zhì)量濃度梯度的BCA蛋白質(zhì)標準品，其中，質(zhì)量濃度范圍為20～2 000 μg/mL。把試劑盒中的試劑A和試劑B按照說明書的比例即50∶1，混合均勻制作工作液。然后使用移液槍向每個微孔中加入25 μL的標準品或未知樣本，并依次向每個微孔中加入200 μL的工作液。將酶標板放在振蕩器上使用400 r/min 震蕩30 s，將樣本和工作液充分混合，將混合后的酶標板放入37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，待96孔酶標板冷卻至室溫，使用酶標儀換入562 nm的濾光片檢測酶標板微孔中蛋白濃度。使用商用酶標儀檢測完成后，用同樣的方式采集全波段蛋白檢測儀獲取BCA實驗后的圖像如圖5所示

圖5 BCA蛋白濃度測定實驗圖像Fig. 5 The experimental result of BCA protein testing

3 結(jié)果與討論

3.1 標準曲線

Human Pentraxin 3/TSG-14酶聯(lián)免疫吸附實驗和BCA蛋白濃度測定實驗均適用于合四參數(shù)擬合模型[14-15]，而未知樣本質(zhì)量濃度和響應(yīng)的關(guān)系用四參數(shù)擬合模型可表示為

式中：y為樣本在藍色通道下的響應(yīng)值；x為質(zhì)量濃度；a為下漸近線估值，b為曲線斜率值，c為質(zhì)量濃度對應(yīng)于最小響應(yīng)與最大響應(yīng)估計值之間的中間值；d為曲線的上漸近線估值。

全波段蛋白檢測儀通過四參數(shù)擬合模型繪制的標準曲線與商用酶標儀的測試結(jié)果進行對比，評估儀器的性能。

通過圖6可知，PTX3實驗中，全波段蛋白檢測儀根據(jù)OD值擬合的標準曲線擬合優(yōu)度(R2)為0.999 6，而商用酶標儀根據(jù)OD值擬合的標準曲線的擬合優(yōu)度為0.999 8。圖7為BCA顯色實驗結(jié)果圖，根據(jù)OD值擬合的標準曲線擬合優(yōu)度為0.999 7，而商用酶標儀根據(jù)OD值擬合的標準曲線的擬合優(yōu)度為0.999 8。由實驗數(shù)據(jù)表明全波段蛋白檢測儀使用比色算法繪制的PTX3 實驗的標準曲線以及BCA蛋白濃度測定實驗的標準曲線與商用的酶標儀繪制的標準曲線基本一致，且擬合優(yōu)度較高，全波段蛋白檢測儀性能達到檢測要求，并能夠完成多波段的生物顯色實驗。

圖6 PTX3標準曲線 實線代表標準曲線：商用酶標儀虛線代表標準曲線：全波段蛋白檢測儀Fig. 6 PTX3 standard curve. Solid line: standard curve measured from the commercial microplate reader. Dotted line:standard curved measured from the full-band protein detection system.

圖7 BCA標準曲線 實線代表標準曲線：商用酶標儀虛線代表標準曲線：全波段蛋白檢測儀Fig. 7 BCA standard curve. Solid line: standard curve from the commercial microplate reader. Dotted line: standard curve measured from the full-band protein detection system

3.2 未知樣本分析

實驗用42份未知樣本進行PTX3實驗和40份未知樣本進行BCA蛋白濃度檢測實驗，根據(jù)與之相對應(yīng)的標準曲線計算未知樣本的濃度。圖8和圖9為全波段蛋白檢測儀與商用酶標儀測出的參考質(zhì)量濃度值的線性關(guān)系。兩種不同檢測波長實驗中，基于反射式成像光路的全波段蛋白檢測儀與商用酶標儀檢測出的結(jié)果具有很好的一致性，PTX3酶聯(lián)免疫吸附實驗和BCA蛋白濃度檢測實驗中測出的兩者的樣本質(zhì)量濃度誤差在5%以內(nèi)。

圖8 全波段蛋白檢測儀與商用酶標儀檢測PTX3未知樣本質(zhì)量濃度對比圖Fig. 8 Comparison of concentration of unknown PTX3 samples detected by the full-band protein detection system and the commercial microplate reader

圖9 全波段蛋白檢測儀與商用酶標儀檢測BCA未知樣本質(zhì)量濃度對比圖Fig. 9 Comparison of concentration of BCA unknown samples detected by full-band protein detection system and the commercial microplate reader

4 結(jié) 論

在PTX3酶聯(lián)免疫吸附實驗及BCA蛋白濃度測定實驗的基礎(chǔ)上，采用圖像處理比色處理算法，研制出了基于反射式成像光路的全波段蛋白檢測儀。經(jīng)過實驗證明，對于不同波長的顯色實驗，在采集圖片之后利用比色算法和四參數(shù)擬合模型繪制的標準曲線與商用酶標儀繪制的標準曲線結(jié)果基本一致（PTX3:R2=0.999 6，BCA:R2=0.999 7），證明了基于反射式光路的全波段蛋白檢測儀能夠完成檢測。通過反射式的光路設(shè)計將一維成像光程擴展為二維，提高維度減少空間，同時延長光程提高視場范圍，使儀器架構(gòu)更加緊湊，同時采用比色算法在3 s內(nèi)完成檢測，而商用酶標儀檢測時間大多為10 s，大大減少了檢測所需時長，同時降低了使用濾光片或光柵的昂貴成本。