生防菌HY-19的鑒定及其抑菌物質(zhì)研究

路兆軍 苗杰 劉瑞珍 馬旭升 趙瑩 王淑惠 李保進

摘要 [目的]明確HY-19的抑菌物質(zhì)特性及其分類地位。[方法]以蘋果褐斑病等為靶標(biāo)采用平板對峙法分析其拮抗譜，對HY-19進行形態(tài)觀察、生理生化測定和分子鑒定及其抑菌物質(zhì)特性研究。[結(jié)果]菌株HY-19拮抗活性強且抑菌譜廣，綜合形態(tài)、生理生化及系統(tǒng)發(fā)育樹分析，確定HY-19為短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）。HY-19無菌濾液對病原指示菌有拮抗活性，且酸堿穩(wěn)定性、蛋白酶、抗紫外輻射表現(xiàn)良好。HY-19含有豐原素等4種抑菌代謝產(chǎn)物合成基因，表明該菌株可能產(chǎn)生抗菌肽類物質(zhì)，從而達到抑菌效果。[結(jié)論]該研究為蘋果病原真菌的生防制劑開發(fā)與利用提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 短短芽孢桿菌;生物防治;蘋果病原真菌;抑菌物質(zhì)

中圖分類號 S 432.9? 文獻標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）08-0090-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.08.024

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Study on Identification of Biocontrol Strain HY-19 and Its Antibacterial Substances

LU Zhao-jun， MIAO Jie， LIU Rui-zhen et al

（Yantai Forest Resources Monitoring and Protection Service Center， Yantai， Shandong 264000）

Abstract [Objective]In order to confirm the taxonomic position of HY-19 and its antibacterial substance characteristics.[Method]The inhibitory spectrum of HY-19 targeting to apple pathogenic fungi such as Apple Marssonina Leaf Blotch was analyzed by flat-stand method， then the morphological observation， physiological and biochemical determination， molecular identification and antibacterial properties of HY-19 were studied. [Result]The results showed that HY-19 had strong antagonistic activity and broad spectrum of inhibition. HY-19 was identified as Bacillus brevis through morphological， physiological and biochemical and phylogenetic tree analysis. The fermentation filtrate of HY-19 had antagonistic activity against pathogen indicator which showed good acid-base stability， proteolysis-resistant and UV-resistant. HY-19 contains four kinds of antimicrobial metabolite genes such as fengycin which suggested that the strain may produce antimicrobial peptides to achieve antibacterial effect. [Conclusion]This study will lay a foundation for the development and utilization of biocontrol agents against apple pathogenic fungi.

Key words Bacillus brevis;Biocontrol;Apple pathogenic fungi;Antibacterial substances

芽孢桿菌因其分布廣泛、對人畜和環(huán)境安全、抗逆性高、抑菌譜廣、生產(chǎn)成本相對較低等優(yōu)點被開發(fā)成為殺菌劑用于植物病害的生物防治 [1]。拮抗芽孢桿菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)能夠有效抑制植物病原真菌或細菌的生長，從而達到防病和促生的效果 [2]。如Chandel等 [3]研究發(fā)現(xiàn)，該菌可防治由尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici）引起的番茄枯萎病;Bapat等 [4]研究表明，該菌可產(chǎn)生孢外拮抗物質(zhì)來抑制豌豆枯萎病原菌的孢子萌發(fā)、菌絲生長;楊廷雅等 [5]研究發(fā)現(xiàn)，菌株HAB-5產(chǎn)生的14.4 kDa肽對橡膠炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides）、香蕉枯萎病（Fusarium oxysporum f. sp.Cubense，F(xiàn)OC）、香蕉炭疽病（Colletotrichum musae）等多種病原菌均有拮抗活性;菌株MH1對棉花枯萎病（Rhizoctoniasolani Kuhn）有明顯的拮抗作用 [6];菌株MHQl產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)正丁醇對楊桃炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、香石竹疫霉（P hytophthora nicotianae）等多種植物病原真菌有拮抗作用 [7]。

蘋果斑點落葉病、褐斑病等在我國山東、陜西等蘋果主產(chǎn)區(qū)發(fā)生普遍且危害嚴重，是我國蘋果生產(chǎn)上的主要病害 [8-9]。病情大流行時，果樹葉片在8—9月即大量提前脫落，嚴重削弱樹勢，影響果樹的正常生長發(fā)育及來年蘋果的產(chǎn)量與質(zhì)量 [10]。

HY-19為從蘋果根際土壤中分離得到的1株細菌，對蘋果斑點落葉病菌（Alternaria alternata Kiessl）、蘋果褐斑病菌（Marssonina coronaria Davis）、蘋果輪斑病菌（Alternaria mali Roberts）等多種蘋果重要病害具有明顯的拮抗作用。筆者以蘋果褐斑病菌等為靶標(biāo)采用平板對峙法分析其拮抗譜，綜合形態(tài)觀察、生理生化測定和分子鑒定明確其分類地位，通過無菌濾液穩(wěn)定性檢測及抑菌代謝產(chǎn)物合成基因分析，初步推測抑菌物質(zhì)為酯肽類抗生素，為蘋果病原真菌生防制劑的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

HY-19分離自健康蘋果植株根際土壤，煙臺市林業(yè)科學(xué)研究所實驗室保存。

1.2 病原指示菌

蘋果斑點落葉病菌、蘋果褐斑病菌、蘋果圓斑病菌、蘋果輪斑病菌由煙臺市森林資源監(jiān)測保護服務(wù)中心實驗室保存，蘋果輪紋病菌（Physalospora piricola Nose.）、蘋果炭疽病菌[Colletorichum gloeosporioides（Penz.）Sacc.]由煙臺市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。

1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯胡蘿卜培養(yǎng)基（PCDA） [11]用于病原菌的培養(yǎng)、保存;牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（NB）用于細菌液體發(fā)酵、培養(yǎng);牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（NA）用于細菌培養(yǎng)、保存。

1.4 菌株HY-19拮抗譜測定

采用平板對峙法 [12]測定菌株HY-19對病原菌的抑菌活性。采用菌絲生長速率法 [13]測定并計算菌株HY-19無菌濾液對病原菌的抑制率：用滅菌牙簽將菌株HY-19接種到NB培養(yǎng)基上，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，菌液4 ℃，6 000 r/min 離心20 min，取上清液用0.22 μm微孔濾器過濾除菌后4 ℃保存?zhèn)溆谩⒉≡又翞V液濃度為10%的PCDA平板中心，以不含濾液的PCDA平板為對照。計算各處理病原菌菌落直徑及各拮抗菌株對病原菌的抑制率。抑制率=（對照組直徑-試驗組直徑）/（對照組直徑）×100%。

1.5 菌株HY-19的鑒定

1.5.1 形態(tài)與生理生化特征鑒定。

按照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》 [14]和《伯杰氏細菌鑒定手冊》 [15]的方法對HY-19進行形態(tài)鑒定及生理生化特征測定。

1.5.2 16S rDNA基因序列分析。

采用細菌16S rDNA 擴增通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對HY-19進行PCR擴增，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成DNA提取及測序工作。測序結(jié)果與 NCBI 數(shù)據(jù)庫進行Blast核酸序列比對，利用 MEGA 5.0軟件采用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 菌株HY-19無菌濾液穩(wěn)定性檢測

1.6.1 酸堿穩(wěn)定性測定。

對無菌濾液進行pH梯度處理，pH分別為3、4、5、6、7、8、9、10，室溫處理3 h后，將各濾液調(diào)至pH = 7。以蘋果斑點落葉病菌為病原指示菌，采用生長速率法分析抑菌物質(zhì)的酸堿穩(wěn)定性。

1.6.2 蛋白酶對抑菌物質(zhì)的影響。

分別將蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶加入無菌濾液中配制成2 mg/mL溶液，37 ℃水浴2 h。以未經(jīng)酶處理的濾液為對照，以蘋果斑點落葉病菌為病原指示菌，采用生長速率法分析蛋白酶對抑菌物質(zhì)的影響。

1.6.3 紫外輻射對抑菌物質(zhì)的影響。

將無菌濾液置于紫外燈下分別照射0、2、4、6、8、10、12、24 h，以蘋果斑點落葉病菌為病原指示菌，采用生長速率法研究紫外輻射對抑菌物質(zhì)的影響。

1.7 菌株HY-19抑菌代謝產(chǎn)物合成基因檢測

以菌株HY-19總DNA為模板，以細胞壁組分糖醛酸磷壁酸質(zhì)合成基因為對照，用相應(yīng)引物 [16]分別對豐原素（Fengycin）、桿菌溶素（Bacilysin）、表面活性素（Surfactin）、伊枯草菌素（Iturin）合成相關(guān)基因部分片段進行PCR擴增，檢測菌株HY-19是否含有相應(yīng)的抑菌代謝產(chǎn)物合成基因。

1.8 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法進行多重比較及顯著性分析（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株HY-19拮抗譜測定

菌株HY-19對不同病原菌具有不同程度的拮抗活性（圖1），其中對蘋果斑點落葉病菌、蘋果圓斑病菌、蘋果輪斑病菌的抑菌帶寬度分別為2.62、2.41、1.15 cm，對蘋果輪紋病菌、蘋果炭疽病菌、蘋果褐斑病菌的抑菌帶寬度分別為0.94、0.77、0.52 cm。菌絲生長速率法測定結(jié)果表明，菌株HY-19發(fā)酵濾液對蘋果褐斑病菌、蘋果斑點落葉病菌抑制率較高，分別為60.35%、58.62%，對蘋果圓斑病菌、蘋果輪斑病菌、蘋果輪紋病菌的抑制率次之，對蘋果炭疽病菌的抑制率最低，僅10.21%。

2.2 拮抗菌的鑒定

2.2.1 形態(tài)特征。

菌株HY-19在NA培養(yǎng)基上菌落近圓形，邊緣平整，白色，表面光滑有光澤（圖2a）;菌體短桿狀，革蘭氏陽性 [17]（圖2b）。

2.2.2 生理生化鑒定。

該菌株為好氧菌，其需氧性、硝酸鹽還原、明膠液化等測定為陽性反應(yīng)，葡萄糖發(fā)酵、淀粉水解反應(yīng)為陰性，具體生理生化鑒定結(jié)果見表1。

2.2.3 16S rDNA測序分析。

對菌株HY-19的16S rDNA基因片段進行PCR擴增，并對PCR產(chǎn)物測序，測序結(jié)果表明該區(qū)段的長度為1 444 bp，綜合比對結(jié)果顯示，菌株HY-19與短短芽孢桿菌[Brevibacillus brevis （AY887081.2）]的同源性最近且屬同一分支（圖3），結(jié)合形態(tài)特征、生理生化特性及分子鑒定，初步判斷菌株HY-19為短短芽孢桿菌。

2.3 菌株HY-19無菌濾液穩(wěn)定性檢測

2.3.1 酸堿穩(wěn)定性。

由圖4可知，菌株HY-19發(fā)酵濾液在pH為7～9時抑菌活性保持在40%～58%，在pH為7時抑菌活性最強，達58%，在pH為3和10的強酸堿環(huán)境中也可保持20%以上的活性。這說明其耐酸堿穩(wěn)定性較高，但在中性環(huán)境活性最高，在實際應(yīng)用中宜保持中性環(huán)境。

2.3.2 蛋白酶對抑菌物質(zhì)的影響。

分別用蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶處理HY-19發(fā)酵濾液后，與CK相比，其抑菌活性略有下降，但差異不顯著（P<0.05），說明HY-19發(fā)酵濾液中可能不含或僅含少量蛋白類抑菌活性物質(zhì)（圖5）。

2.3.3 紫外輻射對抑菌物質(zhì)的影響。

HY-19發(fā)酵濾液經(jīng)紫外線處理后，對蘋果斑點落葉病菌的抑制效果略有下降，但差異不顯著（P<0.05），且抑菌率均在54%以上，說明紫外線對HY-19發(fā)酵濾液抑菌活性無顯著影響（圖6）。

2.4 菌株HY-19抑菌代謝產(chǎn)物合成基因檢測

為了驗證HY-19是否含有抑菌代謝產(chǎn)物合成基因，提取菌株全基因組后擴增豐原素、桿菌溶素、表面活性素、伊枯草菌素合成基因目的片段，結(jié)果表明（圖7），4種脂肽類抗生素目的片段均能擴增成功，證明HY-19含有相應(yīng)抑菌代謝產(chǎn)物的基因，具備產(chǎn)生相應(yīng)抑菌代謝產(chǎn)物的能力，這些脂肽類抑菌代謝產(chǎn)物可能是HY-19發(fā)揮抑菌活性的關(guān)鍵因素。

3 結(jié)論與討論

該研究以蘋果褐斑病菌、蘋果斑點落葉病菌為靶標(biāo)，從蘋果植株根際土壤分離純化得到的菌株中篩選到1株拮抗菌株HY-19。該菌株對6種蘋果病原菌具有不同程度的拮抗活性菌，對蘋果褐斑病菌、蘋果斑點落葉病菌抑制率較高，分別為60.35%、58.62%。 通過形態(tài)觀察、生理生化測定及分子生物學(xué)鑒定，初步判定HY-19為短短芽孢桿菌（Bacillus brevis）。 HY-19無菌濾液對蘋果斑點落葉病菌拮抗活性的酸堿穩(wěn)定性、蛋白酶、抗紫外輻射表現(xiàn)良好。HY-19含有豐原素等4種抑菌代謝產(chǎn)物合成基因，推測HY-19發(fā)酵產(chǎn)生的脂肽類抗生素是其具有拮抗活性的主要原因。

短短芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌、嚴格好氧，可產(chǎn)生抗逆性內(nèi)生孢子，廣泛分布于土壤、淤泥、巖石等環(huán)境中 [18]，其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物包括多種類型，其中一些物質(zhì)有明顯的抑菌作用 [19]。這些抑菌物質(zhì)主要包括由核糖體合成的抗菌蛋白、細菌素，由非核糖體合成的酯肽類物質(zhì)或其他活性物質(zhì) [20]。其中酯肽類物質(zhì)具有高效、穩(wěn)定、廣譜、安全無毒、無污染等特性，在農(nóng)業(yè)、環(huán)保等多個領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景 [21]。魏新燕等 [22]研究發(fā)現(xiàn)，甲基營養(yǎng)性芽孢桿菌BH21的脂肽粗提物對灰霉菌菌絲生長抑制率可達73.9%。劉萍等 [23]研究表明，解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的伊枯草菌素Bacillomycin D對金黃色葡萄球菌的生長具有顯著抑制作用。董偉欣等 [24]證實豐原素在枯草芽孢桿菌 NCD-2對灰霉病菌的抑制作用中發(fā)揮主要功能。

目前蘋果生產(chǎn)中對常見真菌性病害以化學(xué)防治為主，施藥頻次高，對環(huán)境及果品影響較大 [25]，因此，開發(fā)高效、廣譜、穩(wěn)定的微生物殺菌劑具有重要的現(xiàn)實意義。目前國內(nèi)鮮見短短芽孢桿菌防治蘋果早期落葉病的相關(guān)報道，該研究篩選出的HY-19對2種蘋果主要病害的拮抗活性較高，具有一定的開發(fā)和應(yīng)用價值。

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