新型冠狀病毒肺炎細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)變化及與主要臨床結(jié)局的關(guān)系

張宏英， 方素芳， 王婷， 黃明翔， 王垚， 陳力舟

新型冠狀病毒肺炎(Coronavirus disease 2019, COVID-19)是由嚴(yán)重呼吸道綜合征冠狀病毒 2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)引起的新型呼吸道傳染性疾病，首例病例于2019年12月報(bào)道，隨后各國(guó)相繼出現(xiàn)大規(guī)模的病例報(bào)告，成為重大全球衛(wèi)生公共事件，徹底改變了社會(huì)秩序。SARS-CoV-2感染后臨床表現(xiàn)差別巨大，病情嚴(yán)重程度不一，病情危重者可快速進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征或多器官功能衰竭等[1-2]。研究表明，淋巴細(xì)胞亞群的變化與病情密切相關(guān)[3]，細(xì)胞因子水平失衡所致細(xì)胞因子風(fēng)暴可能參與了疾病發(fā)展過(guò)程。本研究擬探討病情不同嚴(yán)重程度的COVID-19 患者住院期間及出院后1個(gè)月的輔助性T細(xì)胞(helper T cell, Th，包括Th1、Th2和Th17)分泌的細(xì)胞因子水平的動(dòng)態(tài)變化，了解COVID-19病情發(fā)展的免疫機(jī)制，制定有效的治療策略以改善臨床主要結(jié)局。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 收集2020年1月25日—5月2日在福建省福州肺科醫(yī)院確診的COVID-19患者，所有患者收住院前均經(jīng)過(guò)至少2次核酸檢測(cè)證實(shí)為陽(yáng)性，診斷及病情分型標(biāo)準(zhǔn)參考國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》[4]。輕型和普通型為輕癥組，重型和危重型為重癥組。排除孕婦及兒童。本研究為前瞻性、單中心研究，遵循赫爾辛基宣言，研究方案通過(guò)筆者醫(yī)院倫理委員會(huì)審核[2020-001(科研)-01]，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法 入組患者分別于入院后第4—6天、第7—10天、第11—15天及出院后1個(gè)月留取外周靜脈血，3 000 r/min離心15 min后凍存于-80 ℃冰箱，留待批量檢測(cè)。收集入組患者的人口學(xué)特征(性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙史)，臨床特征(如合并癥、入院時(shí)癥狀等)，入院時(shí)的檢驗(yàn)及檢查資料，治療方案(如抗病毒、免疫調(diào)節(jié)治療等)，預(yù)后(生存、死亡)。

1.3 細(xì)胞因子檢測(cè) 白細(xì)胞介素(interleukin， IL) 2、IL-4、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)、干擾素(interferon, IFN) γ、IL-17A及IFN-α檢測(cè)采用細(xì)胞微球芯片技術(shù)(cytometric bead array, CBA)，試劑盒為BD CBA Human Th1/Th2/Th17 Cytokines Kit(批號(hào)560484，美國(guó)BD公司)及 Human IFN-Alp CBA Flex Set (批號(hào)560379，美國(guó)BD 公司)，流式細(xì)胞儀(BD FACS Calibur，美國(guó)BD公司)檢測(cè)、CBA專用分析軟件(FCAP Array v1.0，美國(guó)BD公司)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及數(shù)據(jù)分析。操作步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 基本情況 共入組36例患者，重癥組5例，均為重型COVID-19，其中男性2例，女性3例，年齡(69.0±12.4)歲(57～85歲)。輕癥組31例，其中輕型2例，普通型29例，女性15例，男性16例，年齡(42.6±14.4)歲(20～72歲)。重癥組年齡大于輕癥組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。兩組患者的男女性別組成、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙史方面比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組患者最常見(jiàn)的癥狀為發(fā)熱(21/36，58.3%)和咳嗽(19/36，52.8%)，氣促、咳痰、胸悶和乏力肌痛發(fā)生率低，兩組患者呼吸道相關(guān)癥狀發(fā)生率比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。重癥組5例均合并心腦血管病史，比例高于輕癥組(100.0%vs25.8%，P=0.003，表1)。

表1 兩組患者基線特征比較Tab.1 Comparison of base data between mild and severe patients

2.2 輔助檢查 重癥組白細(xì)胞(white blood cell, WBC)及中性粒細(xì)胞(counting and neutrophil, NEU)計(jì)數(shù)低于輕癥組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，P=0.049)；重癥組乳酸脫氫酶(higher lactate dehydrogenase, LDH)、D-二聚體(D dimer, D-D)、C反應(yīng)蛋白(C reactive protein, CRP)的值均高于輕癥組，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其他檢驗(yàn)指標(biāo)如淋巴細(xì)胞、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、肌酸激酶及降鈣素等比較，差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2)。

表2 兩組患者檢驗(yàn)結(jié)果比較Tab.2 Comparison of laboratory findings between mild and severe patients

2.3 治療及轉(zhuǎn)歸 入院后所有患者均給予抗病毒治療，藥物包括阿比朵爾、α-干擾素、洛匹那韋/利托那韋，免疫治療藥物包括胸腺法新、人血白蛋白、糖皮質(zhì)激素及恢復(fù)期血漿。重癥組中，4例應(yīng)用胸腺法新，1例應(yīng)用人血白蛋白，2例應(yīng)用糖皮質(zhì)激素，1例應(yīng)用恢復(fù)期血漿；輕癥組中9例應(yīng)用胸腺法新。重癥組4例應(yīng)用氧療(4/5， 80.00%)，輕癥組2例應(yīng)用氧療(2/31， 6.45%)。兩組患者入院后的熱退時(shí)間、核酸陰轉(zhuǎn)時(shí)間、住院天數(shù)比較，差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表3)。無(wú)死亡病例。

表3 兩組患者主要臨床結(jié)局比較Tab.3 Comparisons of main clinical outcome between mild and severe patients

2.4 細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果 輕癥組和重癥組的IL-2、IFN-γ、IFN-α、TNF、IL-4及IL-17A值比較，差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。重癥組IL-6、IL-10水平高于輕癥組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001，P<0.001)。兩組患者IL-6、IL-10值在不同時(shí)間段、不同時(shí)間段的變化率兩兩比較，可見(jiàn)IL-6值在入院后逐漸升高，第7—10天時(shí)達(dá)高峰，隨后逐漸下降，到出院1個(gè)月時(shí)達(dá)最低水平。重癥組在第7—10天時(shí)為91.95(39.60，146.65) pg/mL，第11—15天時(shí)為106.41(75.71，125.19) pg/mL，第4—6天時(shí)為70.08(41.14，71.66) pg/mL，出院后1個(gè)月時(shí)為3.95(3.85，6.91) pg/mL；IL-10則是入院第4—6天即達(dá)高峰，隨后逐漸下降，入院第11—15天降至最低水平并維持到出院后1個(gè)月，重癥組在第4—6天時(shí)為(13.42±9.02) pg/mL，第7—10天時(shí)為(9.70±3.06) pg/mL，第11—15天時(shí)為(7.10±5.90) pg/mL，出院后1個(gè)月時(shí)為(5.99±4.50) pg/mL(表4—6，圖1，2)。

表4 兩組患者細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果Tab.4 Cytokines level in mild and severe patients

表5 兩組患者細(xì)胞因子重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果Tab.5 Results of repeated measure ANOVA for cytokines level in two groups

表6 兩組患者細(xì)胞因子廣義線性模型固定效應(yīng)結(jié)果Tab.6 Fixed effect results of generalized linear model for cytokines level in two groups

圖1 兩組患者的白細(xì)胞介素6水平比較Fig.1 The IL-6 level of mild and severe patients

圖2 兩組患者的白細(xì)胞介素10水平比較Fig.2 The IL-10 level of mild and severe patients

2.5 細(xì)胞因子與臨床主要結(jié)局直線回歸分析 將各細(xì)胞因子各時(shí)間段的值與主要臨床結(jié)局(包括熱退時(shí)間、核酸陰轉(zhuǎn)時(shí)間、住院天數(shù))進(jìn)行直線回歸分析，結(jié)果提示，入院第4—6天的IL-6水平與熱退時(shí)間相關(guān)(r=0.539)，提示IL-6值越高熱退時(shí)間越長(zhǎng)；而第4—6天的IL-10水平與核酸陰轉(zhuǎn)時(shí)間相關(guān)(r=0.466)，提示IL-10值越高核酸陰轉(zhuǎn)時(shí)間越長(zhǎng)(圖3，4)。

圖3 患者第4—6天IL-6水平與熱退時(shí)間散點(diǎn)圖Fig.3 Correlations between IL-6 (Day 4-6) and time of fever relieving

圖4 患者第4—6天IL-10水平與核酸陰轉(zhuǎn)時(shí)間散點(diǎn)圖Fig.4 Correlations between IL-10 (Day 4-6) and time of virus acid negative conversion

3 討 論

COVID-19為新發(fā)急性呼吸道傳染病，由β屬的冠狀病毒感染所致，該病毒可跨種族傳播。研究顯示，SARS-CoV-2病毒表面S蛋白識(shí)別并結(jié)合人呼吸道上皮細(xì)胞血管緊張素轉(zhuǎn)換酶Ⅱ(angiotensin converting enzyme Ⅱ， ACE2)受體后進(jìn)入宿主細(xì)胞[5]。SARS-CoV-2在淋巴結(jié)和脾等免疫器官大量增殖，破壞淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，從而導(dǎo)致淋巴細(xì)胞水平下降。病理解剖也發(fā)現(xiàn)，雖然肺泡腔和肺間隔內(nèi)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，但同時(shí)也存在CD4+和CD8+T 細(xì)胞過(guò)度激活，表現(xiàn)為CD4+T細(xì)胞中高度促炎性CCR4+、CCR6+和Th17增加，CD8+T細(xì)胞的高細(xì)胞毒性[6]。因此，病毒感染后適度的固有免疫和獲得性免疫反應(yīng)可迅速控制病毒，失衡的免疫應(yīng)答會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞因子風(fēng)暴和高病死率。

既往研究發(fā)現(xiàn)，重癥SARS和MERS均存在不同程度的細(xì)胞因子風(fēng)暴[7-8]，并引起細(xì)胞免疫功能紊亂，表現(xiàn)為IFN-γ、TNF-α、IL-15、IL-17A及IFN-α升高。COVID-19和SARS、MERS均為β屬的冠狀病毒所致，但現(xiàn)有的數(shù)據(jù)表明，COVID-19的死亡率低于后兩者[9]，推測(cè)參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子可能不盡相同，導(dǎo)致組織損傷程度不同。2019年12月COVID-19爆發(fā)以來(lái)，關(guān)于細(xì)胞因子在COVID-19中表達(dá)的研究[10]也證實(shí)了這一猜測(cè)，重癥患者外周血的IL-6、IL-10、IL-2、IFN-γ、IL-2R、IL-8和TNF-α較輕癥患者明顯升高，且NEU和LYM計(jì)數(shù)的比值、NEU與CD8+T細(xì)胞的比值與患者預(yù)后密切相關(guān)，是疾病進(jìn)展的重要預(yù)測(cè)標(biāo)志物。本研究中，重癥組的IL-6和IL-10水平高于輕癥組，與上述研究結(jié)果一致。對(duì)不同時(shí)間段IL-6值兩兩比較發(fā)現(xiàn)，患者入院后IL-6進(jìn)行性升高，住院第7—10天時(shí)達(dá)到高峰，隨后開(kāi)始下降，到出院后1個(gè)月降至最低值。與輕癥組比較可見(jiàn)，重癥組在入院第4—6天至第7—10天之間變化率為80.32%，高于輕癥組的38.96%，表明這段時(shí)間重癥組IL-6值上升較快，增幅明顯高于輕癥組。本研究直線回歸分析發(fā)現(xiàn)，入院第4—6天的IL-6水平與熱退時(shí)間呈正相關(guān)。因此，對(duì)于重癥患者，入院10 d內(nèi)的病情監(jiān)測(cè)非常重要，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)IL-6對(duì)早期識(shí)別細(xì)胞因子風(fēng)暴具有重要的預(yù)后和治療意義[11]。對(duì)于存在細(xì)胞因子風(fēng)暴的患者，適時(shí)啟動(dòng)適量的抗炎治療可能有助于改善預(yù)后。GUARALDI等[12]報(bào)道，33例重癥COVID-19 患者接受了IL-6受體單克隆抗體托珠單抗治療，與標(biāo)準(zhǔn)治療組比較，降低了死亡率或有創(chuàng)機(jī)械通氣風(fēng)險(xiǎn)(HR=0.61，P=0.02)，但新發(fā)感染發(fā)生率也高于標(biāo)準(zhǔn)治療組(13%vs4%，P<0.000 1)。一項(xiàng)隨機(jī)、安慰劑對(duì)照的COVACTA研究證實(shí)，托珠單抗可縮短中度缺氧使用有創(chuàng)機(jī)械通氣的COVID-19患者的住院時(shí)間[13]。IL-10的動(dòng)態(tài)變化與IL-6略有不同，入院第4—6天即達(dá)高峰，隨后開(kāi)始下降，入院第11—15天時(shí)降到最低水平，而后一直保持穩(wěn)定水平，直至出院后1個(gè)月。因此，在疾病剛剛發(fā)生階段需重視IL-10的絕對(duì)值。本研究直線回歸分析提示，IL-10水平與核酸陰轉(zhuǎn)時(shí)間呈正相關(guān)，提示IL-10值越高，核酸陰轉(zhuǎn)時(shí)間越長(zhǎng)。因此，COVID-19 的傳染性與其免疫功能恢復(fù)息息相關(guān)。

IL-4、IL-6和IL-10是Th2輔助T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，而IL-2、IFN和TNF則是Th1輔助T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，通常Th1和Th2細(xì)胞之間通過(guò)分泌細(xì)胞因子，彼此進(jìn)行交叉調(diào)節(jié)、相互抑制，故在免疫應(yīng)答的起動(dòng)階段，如果某一亞群免疫細(xì)胞應(yīng)答占據(jù)主要地位，那么這種Th細(xì)胞就會(huì)正反饋地加強(qiáng)自身增殖，并抑制另一亞群發(fā)展，Th1/Th2愈來(lái)愈不平衡是細(xì)胞因子過(guò)度釋放、靶器官損傷的根源。本研究組重癥組IL-6和IL-10水平明顯高于輕癥組，說(shuō)明重癥組患者存在免疫失衡。但本研究?jī)山M患者間IL-2、IFN-γ、IFN-α、TNF、IL-4和IL-17A水平比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道[3，14-15]顯示，以上部分指標(biāo)在輕癥和重癥組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，部分指標(biāo)則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。考慮可能與以下原因有關(guān)：(1)影響Th1/Th2分化除了上述的細(xì)胞因子外，還有遺傳、病原體等因素。(2)與入組患者病情組成有關(guān)，本研究重癥組患者例數(shù)較少，且5例均為重型患者，無(wú)危重型患者，可能存在數(shù)據(jù)偏移。(3)與采集外周血的時(shí)間有關(guān)。(4)本研究無(wú)死亡患者，且兩組患者LEU計(jì)數(shù)、動(dòng)脈血氧分壓比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，也說(shuō)明入組患者預(yù)后相對(duì)較好，故炎癥失衡的程度可能較低。

綜上所述，重癥COVID-19患者的WBC和NEU計(jì)數(shù)下降，LDH、D-D和CRP升高，IL-6和IL-10水平在疾病早期即明顯升高，并且與熱退時(shí)間、核酸陰轉(zhuǎn)時(shí)間相關(guān)，其他細(xì)胞因子水平變化不明顯，提示存在免疫失衡。及時(shí)清除炎癥介質(zhì)、降低炎癥水平可能可以改善預(yù)后，但是最佳用藥時(shí)機(jī)、療效和安全性評(píng)估還需要有大樣本的研究來(lái)證實(shí)。