結直腸癌患者的腸道菌群變化情況分析

章菲菲 毛凌燕 蔡娟 王慧君

201103 中國人民武裝警察部隊上海市總隊醫院內二科，上海

結直腸癌是發生于結直腸上皮的惡性腫瘤，全球范圍內，結直腸癌是第三位常見的惡性腫瘤，也是第二位常見的惡性腫瘤死亡原因[1]。《2020年中國癌癥統計數據》顯示，結直腸癌的發病率高居第二位，發病率呈逐年上升趨勢[2]。在一定情況下，腸道微生態和內環境的改變可誘發結腸癌，導致腫瘤進展。人體只有在腸道微生態的種類、數量和比例保持平衡的前提下，才能維持正常的腸道內環境[3]。有研究顯示，經大腸癌患者的糞便灌胃給藥后，小鼠可發生腸腫瘤和腸上皮發育不良，為大腸癌患者腸道菌群的促瘤作用提供了直接證據[4]。近年來，已證實腸道菌群與大腸癌的發生、發展和治療有關，潛在的致病菌和代謝標志物的發現將有助于結直腸癌患者的早期診斷和有效治療[5]。本研究擬通過結直腸癌患者和正常人群腸道菌群的檢測和比較，探尋腸道菌群在腫瘤患者中的變化特點。

資料與方法

選取2014年10月-2019年12月中國人民武裝警察部隊上海市總隊醫院診治的結直腸癌患者8例為病例直腸癌組。12名正常人為對照組。

本研究病例組共有患者8 例(一般資料詳見表1)，其中男1 例，女7 例；年齡23～69 歲，平均(53.63±14.99)歲。正常對照組男5 人，女7 人；年齡35～68歲，平均(49.17±9.16)歲。兩組一般資料具有可比性。

表1 病例組患者的一般資料

納入標準：初次確診結直腸癌。

排除標準：檢查前1 個月內服用過抗生素或微生態制劑。既往有糖尿病、慢性肝腎疾病史或惡性腫瘤史。

方法：通過糞便高通量測序進行腸道菌群檢測。(1)樣本收集：用清潔容器收集研究對象的新鮮糞便3 g，液氮保存送檢。(2)脫氧核糖核酸(DNA)抽提和聚合酶鏈反應(PCR) 擴增：根據e.z.n.a?土壤DNA 試劑盒(Omega-Bio-tek，Norcross，GA，U.S.)說明對糞便進行微生物群落總DNA 提取，DNA 提取質量通過1%瓊脂糖凝膠電泳判斷，同時完成DNA 濃度和純度測定；用338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')引物通過PCR 擴增16S rRNA 基因的v3-v4 可變區序列。擴增步驟如下：①95℃預變性3 min；②27 個循環(95℃變性30s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s)；③在72℃下穩定延伸10 min；④儲存于4℃(PCR 儀器：ABI GeneAmp?9700 型)。PCR 反應體系：5×緩沖液(Trans Start Fast Pfu)4 μL，2.5 mM 脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)2 μL。上游引物1(上游，5 μM)0.8 μL。引物2(下游，5 μM)0.8 μL。DNA 聚合酶(Trans Start Fast Pfu)0.4 μL。模板DNA 10 ng，雙蒸水ddH2O 補充至20 μL。每個樣品重復3 次。(3)Illumina Miseq 測序：PCR 產物通過2%瓊脂糖凝膠回收，產物通過Axy Prep DNA 凝膠提取試劑盒(Axygen Biosciences，Union City，USA)純化，然后通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。使用熒光計(美國Promega)定量檢測回收產物。使用NEXTflex ?Rapid DNA-seqKit(bio scientific，USA)構建基因組文庫：①連接子鏈接；②磁珠篩選后，移除接頭的自連片段；③PCR 擴增富集文庫模板；④通過磁珠回收PCR 產物以獲得最終的基因組文庫。測序由Miseq 高通量測序儀pe300 平臺(Illumina)完成(上海美吉生物醫學科技有限公司)。(4)數據處理。(5)將Fastp 數據質控軟件(https://github. com/OpenGene/fastp ，版本0.20.0)用于原始測序序列的質量控制，使用flash(http://www.cbcb.umd.edu/software/flash ，版本1.2.7)軟件完成基因序列拼接：①過濾讀取尾質量值＜20 的堿基，設置50 bp 為窗口，如果窗口中的平均質量值＜20，則從窗口中切斷后端堿基，質量控制后過濾50 bp 以下的讀取，刪除包含N 堿基的讀取；②根據PE 讀取之間的重疊關系，將成對讀取拼接成一個序列，最小重疊區域長度為10 bp；③剪接序列重疊區域的錯配率為≤0.2，對不一致序列進行篩選；④根據DNA 序列兩端的條形碼和引物區分樣本，并調整序列方向，DNA 條形碼允許錯配數為0，引物最大錯配數為2。通過uparse 富文本解析器軟件( http://drive5.com/uparse/，版本7.1)，并根據97% 相似性標準對序列進行操作分類單元OTU 聚類后移除嵌合體。使用RDP 序列分類器的貝葉斯算法(http://rdp.cme.msu.edu/，版本2.2)注釋每個序列的物種分類，并將其與Silva 16S rRNA 微生物多樣性數據庫(版本138)進行比較。比較閾值設置為70%。

觀察指標：病例組和對照組的腸道菌群組成與豐度。

結 果

腸道細菌群落組成與豐度占比差異：柱形圖顯示，在屬水平上病例組與對照組的群落組成與豐度占比有一定的差異。

腸道菌群在屬水平上的組間差異：結直腸癌患者存在擬桿菌屬、腸桿菌屬、梭桿菌屬富集現象，但產丁酸鹽細菌減少。見圖1。

圖1 病例組與對照組腸道菌群構成柱形圖

結直腸癌患者存在獨特的菌屬：維恩(VENN)圖顯示，結直腸癌患者含有的獨有物種存在4類獨特的菌屬：伯克氏菌、黃桿菌、顫螺旋菌、未分類藍藻，可能屬于病原菌/條件致病菌。見圖2。

圖2 病例組和對照組中的獨有菌屬(VENN圖)

討 論

現有證據顯示，結直腸癌、腸道腺瘤的發生都與腸道微生態有關，因此通過分析結直腸良惡性腫瘤患者的腸道菌群結構，篩選出具有結直腸癌、結腸腺瘤患者的特征性菌群組成，可能對結直腸腫瘤的診斷和防治有臨床參考價值[6-7]。目前認為患者腸道中具核梭桿菌、糞腸球菌、大腸桿菌、腸桿菌屬脆弱類桿菌作用于致癌信號通路及關鍵基因，與結直腸癌的發生密切相關[8]。腸道菌群可以通過各種方式促進結直腸癌的發展，如在誘發慢性炎癥的基礎上，通過炎癥信號通路導致腫瘤的發生，通過氧自由基、毒性代謝物和致癌物的合成，影響宿主的代謝，誘發DNA 的損傷，從而改變干細胞動力學和調節細胞凋亡。

本研究樣本量雖然較少，但腸道菌群多樣性檢測結果與現有研究一致，病例組的糞便標本存在下列特點：①腸道菌群中產丁酸鹽細菌明顯下降；②擬桿菌屬、腸桿菌屬和梭桿菌屬富集現象。本研究同時還發現結直腸癌患者存在四類獨特的菌屬：伯克氏菌、黃桿菌、顫螺旋菌、未分類藍藻，可能屬于病原菌/條件致病菌。基于現有研究結果，調查結直腸腫瘤患者的腸道菌群結構變化有望為結直腸癌的診斷、生物標志物和治療干預策略提供有價值的信息[9]。具核梭狀芽孢桿菌與結直腸癌的研究結果表明，腸道菌群有望成為結直腸癌及其癌前疾病早期篩查的標志物，并有助于發現高危人群；利用微生態學及其代謝產物可以預測結直腸癌及其癌前病變的預后；以微生態學及其代謝產物為靶點，也為大腸癌及其癌前疾病的防治提供了新的思路和方向。由于腸道菌群的數量龐大，影響因素眾多，這給研究造成了很大的困難。隨著宏觀基因組學及二代測序等新技術的發展，結直腸腫瘤與腸道微生態的關系將得以進一步明確，有望為結直腸癌防治策略提供新的理論依據。糞菌宏基因組測序很可能成為結直腸癌非侵入性的標記物[10]。擬通過宏基因組學對結腸腫瘤患者腸道菌群進行分析，同時增加樣本量和細化分層因素，以期得到更有針對性的結果。