鐵調節蛋白2高表達對MPP+誘導的PC12細胞損傷的影響

(青島大學基礎醫學院，山東省神經相關疾病的機制與重點防治實驗室，山東省沿海地區神經退變疾病協同創新中心，山東 青島 266071)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一類常見的神經系統退行性疾病，PD主要的病理改變是中腦黑質致密部多巴胺(DA)能神經元的變性死亡，進而引起紋狀體DA含量顯著降低[1]。雖然導致這一病理改變的確切病因目前仍不清楚，但腦內黑質鐵異常聚集被認為是一種重要的致病因素[2]。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)是一種常用的PD小鼠造模的神經毒素，可以選擇性地損傷黑質中的DA能神經元并且誘發PD。MPTP在星形膠質細胞中可被代謝為1-甲基-4-苯基吡啶陽離子(MPP+)，之后再通過DA轉運體進入DA能神經元并導致其氧化應激水平升高[3]。目前研究發現，MPTP誘導的PD小鼠模型的黑質中，鐵水平升高且DA能神經元丟失[4]。MPP+能夠引起細胞內鐵的聚集，增強轉鐵蛋白受體1(TFR1)和二價金屬轉運蛋白1(DMT1)的表達[5-6]。

鐵調節蛋白2(IRP2)在維持細胞鐵穩態中發揮著重要作用[7-10]。本課題組前期研究顯示，MPP+誘導的PD細胞模型內IRP2表達水平下降[11]，這提示IRP2蛋白在MPP+誘導的PD模型中可能發揮潛在作用。但高表達IRP2如何影響MPP+的細胞毒性仍不清楚，本實驗旨在探討IRP2高表達在MPP+誘導PC12細胞損傷中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

PC12細胞購于中國科學院上海生命科學研究所；MPP+、CCK-8試劑盒購買于美國Sigma公司；胰酶購于美國Biosharp公司；多功能酶標儀購于芬蘭Perkinelmer公司；LipotamineTM2000購于美國Invitrogen公司；IRP2抗體購自美國Abcam公司；β-Actin抗體購于美國CST公司；Myc-vector空載質粒和攜帶IRP2基因的Myc-IRP2質粒來自實驗室前期構建。

1.2 PC12細胞培養

將PC12細胞置于含體積分數0.10的胎牛血清及100 kU/L青霉素和鏈霉素(1∶1)的DMEM培養基中，在37 ℃、含體積分數0.05的CO2培養箱中傳代培養，每2～3 d傳代一次，待PC12傳到第3代且細胞融合度約90%時用于后續實驗。

1.3 MPP+溶液濃度的篩選

將處于對數生長期的PC12細胞接種于96孔板中，待細胞生長24 h且完全貼壁以后，分別加入含有不同濃度(0、1、2、3、4、5 mmol/L)MPP+的DMEM培養基，每種濃度設置6個復孔。將孔板置于37 ℃、含體積分數0.05的CO2培養箱中培養24 h后，每孔中加入CCK-8溶液10 μL，將孔板在培養箱中孵育1～4 h，使用酶標儀測量各組溶液在波長450 nm處的吸光度(A)值。計算各組細胞存活率。細胞存活率=[(A實驗孔-A空白孔)/(A對照孔-A空白孔)]×100%。選擇引起細胞損傷的最低濃度，用于后續實驗。

1.4 分組及處理

將每孔約1×105個PC12細胞接種于96孔板中，培養24 h后使用LipotamineTM2000將Myc-vector和Myc-IRP2質粒分別轉染PC12細胞。后在37 ℃、含體積分數0.05的CO2培養箱中培養6～8 h后，將包含有LipotamineTM2000的DMEM培養基換成含體積分數0.10胎牛血清的DMEM培養基，繼續培養24 h后備用。然后依據處理方式不同將細胞分為4組：①vector組：Myc-vector質粒轉染后在含有體積分數0.10胎牛血清的DMEM培養基中培養24 h；②vector/MPP+組：Myc-vector質粒轉染后在含2 mmol/L MPP+的DMEM培養基中培養24 h；③IRP2組：Myc-IRP2質粒轉染以后在含體積分數0.10胎牛血清的DMEM培養基中培養24 h；④IRP2/MPP+組：Myc-IRP2質粒轉染后在含2 mmol/L MPP+的DMEM培養基中培養24 h。

1.5 免疫印跡法檢測PC12細胞中IRP2相對表達水平

將培養好的細胞接種于96孔板，待PC12細胞融合度約50%時，按1.4步驟處理細胞48 h后，收集PC12細胞，提取細胞總蛋白后，加入5×loading buffer，于水中煮沸10 min進行變性。并按照SDS-PAGE凝膠配置說明書配制150 g/L分離膠以及50 g/L的濃縮膠。加入20 μg蛋白樣品至凝膠孔中，進行SDS-PAGE蛋白電泳，PVDF轉膜，然后以50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h。根據目的蛋白分子量裁剪PVDF膜條帶，分別加入IRP2(1∶1 000)和β-actin(1∶10 000)單克隆抗體4 ℃孵育過夜，并以β-actin作為內參照，TBST洗膜后加入二抗并室溫孵育1 h，TBST洗膜。然后加入ECL化學發光液顯影并拍照。使用Image J軟件分析IRP2蛋白條帶灰度值，IRP2蛋白相對表達量以IRP2蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值計算，結果取3次重復實驗的均值。

1.6 PC12細胞活力的檢測

vector組、vector/MPP+組、IRP2組和IRP2/MPP+組細胞經1.4步驟處理后，置于96孔培養板中，每組細胞設置6個復孔，每孔中加入CCK-8溶液10 μL，置于37 ℃、含體積分數0.05的CO2培養箱中孵育1～4 h后，采用酶標儀測量各組溶液在波長450 nm處的吸光度(A)值。計算各組細胞存活率。細胞存活率=[(A實驗孔-A空白孔)/(A對照孔-A空白孔)]×100%。

1.7 統計學處理

2 結 果

2.1 誘導PC12細胞損傷的最低MPP+藥物濃度

CCK-8測定法檢測結果顯示，MPP+濃度為0、1、2、3、4、5 mmol/L培養基中的PC12細胞的存活率分別為(94.04±1.92)%、(87.39±2.32)%、(76.44±5.63)%、(44.64±3.48)%、(32.57±2.96)%，不同濃度間比較差異均有顯著性(F=207.30，P<0.05)。其中，2 mmol/L為引起細胞損傷的最低濃度，因此后續實驗均采用2 mmol/L濃度的MPP+溶液誘導PC12細胞損傷。

2.2 各組PC12細胞中IRP2蛋白的表達水平比較

免疫印跡法檢測結果顯示，vector組、vector/MPP+組、IRP2組、IRP2/MPP+組細胞中IRP2蛋白的相對表達量分別為0.62±0.15、0.50±0.11、1.04±0.09、0.71±0.02，組間比較差異均具有統計學意義(F=15.38，P<0.05)。其中，相較于vector和vector/ MPP+組，IRP2組和IRP2/ MPP+組細胞中IRP2蛋白的相對表達量明顯升高(P<0.05)。見圖1。

A～D分別代表vector組、vector/MPP+組、IRP2組及IRP2/MPP+組圖1 各組PC12細胞中IRP2蛋白的表達水平Fig.1 Protein expression level of IRP2 in each group of PC12 cells

2.3 IRP2高表達對MPP+損傷PC12細胞存活率的影響

CCK-8測定方法檢測結果顯示，vector組、vector/MPP+組、IRP2組、IRP2/MPP+組細胞存活率分別為(101.67±4.70)%、(80.25±5.23)%、(69.39±8.91)%、(58.62±5.27)%。IRP2高表達對MPP+損傷PC12細胞影響的比較采用2×2析因設計方差分析，其中兩因素分別為“轉染類型(是否轉染IRP2質粒)”和“損傷處理(是否進行MPP+處理)”，結果顯示，F轉染類型=111.41，P<0.05；F損傷處理=39.71，P<0.05;F轉染類型*損傷處理=4.34，P<0.05。單獨效應結果顯示，未給予MPP+處理時，兩種轉染類型平均值差值為0.32，P<0.05；給予MPP+處理時，兩種轉染類型平均值差值為0.22，P<0.05；轉染類型為vector時，兩種MPP+處理方式的平均值差值為0.21，P<0.05；轉染類型為IRP2時，兩種MPP+處理方式的平均值差值為0.11，P<0.05。

3 討 論

MPP+是一種常見的PD小鼠造模的神經毒素，由其前體MPTP透過血腦屏障被位于星形膠質細胞線粒體中的單胺氧化酶-B迅速催化生成[12]。MPP+可以通過DA轉運體進入DA能神經元阻斷線粒體NADH氧化呼吸鏈，此過程同時伴有氧自由基的增加和谷胱甘肽的減少，并導致DA能神經元氧化應激水平升高[5]，引起DA能神經元的死亡。MPP+處理PC12細胞被視為一種經典的PD細胞模型制備方法[13]。本研究使用的PC12細胞是一種大鼠的兒茶酚胺類細胞，在形態、生理、生化及功能等方面接近于人中腦DA能神經元。

尸檢研究顯示，PD患者的DA能神經元中鐵水平明顯增高，同時PD患者黑質部位出現鐵聚集，提示腦內鐵穩態的失衡是PD中神經元死亡的關鍵機制[14]。鐵穩態在細胞內受到精密調控[15-16]，當細胞內鐵含量缺乏時，IRPs可與鐵反應元件(IRE)結合；當細胞內鐵充足時，IRPs與IRE的結合便被破壞[8-9,17-18]。在正常生理狀況下，IRP2在腦內的表達水平是動態平衡的，但在病理情況下，IRP2的表達水平將會改變，進而造成細胞內鐵代謝調控紊亂、異常蛋白聚集、細胞周期調控失衡、神經炎癥以及氧化還原穩態失衡等，導致神經退行性疾病的發生[19-21]。IRP2敲除小鼠會表現出PD樣癥狀，其特征是共濟失調、運動遲緩、震顫以及中樞神經系統中的鐵代謝失衡[8,22]。同時，本實驗室前期的研究結果顯示，在MES23.5細胞內以MPP+制備PD模型后，IRP2在細胞內的表達量發生了異常改變[11]。目前IRP2在PD中的作用仍存在一定爭議。

本研究首先采用0、1、2、3、4、5 mmol/L濃度的MPP+處理PC12細胞，并使用CCK-8法檢測細胞存活率，確定2 mmol/L的MPP+處理濃度是造成PC12細胞損傷的最低濃度，并選取作為后續實驗中MPP+誘導損傷PC12細胞的濃度。此后采用免疫印跡法檢測vector組、vector/MPP+組、IRP2組和IRP2/MPP+組細胞中IRP2表達水平，結果顯示，IRP2組、IRP2/MPP+組細胞中IRP2的表達水平均明顯升高，提示IRP2高表達質粒轉染成功。采用CCK-8法檢測上述各組的細胞存活率，兩因素析因設計的方差分析結果顯示，“轉染類型”和“損傷處理”兩因素存在協同作用。單獨效應結果顯示，轉染IRP2質粒和進行MPP+處理均可獨立造成PC12細胞的損傷。以上結果提示，IRP2的高表達不僅可以直接造成PC12細胞的損傷，還能夠加劇MPP+對PC12細胞的損傷，這說明IRP2的穩態在維持細胞正常生理活動中發揮著重要作用。IRP2在細胞內的表達水平受到精細調控，其過高或過低表達都會造成細胞的損傷，但IRP2高表達造成損傷的機制仍需要實驗進行探究。目前IRP2在PD中的作用仍存在一定爭議，有研究指出，IRP2基因的突變不是PD黑質鐵積聚的常見原因[23]，造成這種爭議的原因可能是未將IRPs/IRE結合親和力納入檢測范圍，單純檢測IRP2的表達量不足以判斷IRP2與鐵聚集的相互聯系，因此在后續實驗中可以進一步檢測IRPs/IRE結合親和力在PD細胞模型中是否有改變。除此之外，也需要考慮IRP2是如何參與到MPP+對PC12細胞的損傷過程中的，MPP+一方面可以通過抑制線粒體復合體Ⅰ，造成線粒體功能障礙，影響ATP合成，導致細胞死亡[24-25]；另一方面則是通過誘導細胞DMT1和TFR1的高表達，從而使細胞攝鐵功能增強，造成鐵在細胞內聚集和活性氧的生成，進而導致細胞發生氧化應激[11,26]。IRP2是否參與以上過程，其高表達導致細胞受損的具體機制，均需進一步的實驗驗證。

綜上所述，本研究初步探討了IRP2高表達對MPP+誘導損傷的PC12細胞存活率的影響，發現IRP2高表達能顯著下調PC12細胞存活率，也會加劇MPP+誘導的PC12細胞損傷。提示在MPP+誘導的PD細胞模型中維持細胞內IRP2穩態對細胞存活有著積極作用，為闡明IRP2的調控異常在PD中的作用提供了實驗室數據參考。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

作者貢獻：姜宏、賈鳳菊、姚征洋參與了研究設計；姜宏、賈鳳菊、姚征洋、杜希恂、陳曦、焦倩、傅琳參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文。

Contributions： The study was designed byJIANGHong,JIAFengju, andYAOZhengyang. The manuscript was drafted and revised byJIANGHong,JIAFengju,YAOZhengyang,DUXi-xun,CHENXi,JIAOQian, andFULin. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.