PRSS1和SPINK1基因熱點突變檢測對遺傳性胰腺炎高危人群的診斷價值

張文清,2 雷珂2 魏宏云 王彩霞3 王玲珍3 陳志紅3 李曉宇

(青島大學附屬醫院，山東 青島 266003 1 消化內科； 2 醫學研究中心，腫瘤免疫及細胞治療中心； 3 兒童醫學中心)

遺傳性胰腺炎(hereditary pancreatitis，HP)是一種少見的常染色體顯性遺傳性疾病，其臨床表現與復發性急性胰腺炎(recurrent acute pancreatitis，RAP)和慢性胰腺炎(chronic pancreatitis，CP)相似，占胰腺炎總數的1%[1]。HP與其他原因導致的胰腺炎相比，具有發病年齡早、家族聚集和胰腺癌發病率高等特點[2]。目前HP的發病機制仍不明確，既往遺傳學研究的結果表明，人陽離子胰蛋白酶原(PRSS1)基因突變可引起常染色體顯性HP。除此之外，HP常見突變基因還有絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal 1型(SPINK1)基因和糜蛋白酶C(CTRC)基因等[3]。由于HP與RAP、CP臨床表現類似，基因熱點突變的檢測對明確診斷意義重大。有遺傳變異的HP患者建議40～75歲每年行MRI或CT檢查以確定是否有胰腺腫瘤發生[4]。對于攜帶囊性纖維化跨膜電導調節因子(CFTR)基因突變CP患者可考慮進行基因治療[5]。遺傳咨詢和基因測序可幫助HP患者明確診斷，并及早干預，以預防癌癥的發生。PRSS1和SPINK1基因突變或多態性是HP最常見的突變，據報道中國人群PRSS1基因的常見突變位點為c.86 A>T、c.346 C>T、c.364 C>T、c.365 G>A、c.623 G>C，SPINK1基因常見突變位點為c.101 A>G、c.194+2 T>C[6]。本研究通過檢測PRSS1和SPINK1基因的這7個最常見的熱點突變，對HP高危人群進行篩選并明確病因，以探討PRSS1和SPINK1基因熱點突變檢測對HP高危人群的診斷價值。

1 對象和方法

1.1 研究對象

選擇2020年8月—2021年9月于青島大學附屬醫院消化內科就診的HP高危患者，參考HP患者基因檢測適用人群的標準[7-8]，本研究的HP高危患者納入標準為：有CP、RAP和兒童胰腺炎家族史者；原因不明的RAP或CP患者；親屬有HP確定致病基因突變者；25歲以下發病的特發性CP患者。最后符合條件的患者共6例，男2例，女4例；成人3例，兒童3例；臨床表現為急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)1例，RAP 4例，CP 1例；血清淀粉酶升高者3例，空腹血糖偏高者3例，有腹痛表現者5例，有脂肪瀉者2例，超重者1例，體重下降者1例，有家族史者1例；6例患者均無并發癥發生；腹部CT檢查胰腺有不同程度的低密度影、輪廓飽滿、周圍脂肪間隙密度增高、多發斑點狀鈣質影等異常影像學表現者4例。

1.2 方法

采集6例患者的外周靜脈血各3 mL，然后使用上海生工柱式血液基因組DNA抽提試劑盒提取DNA(B518253-0100)，使用超微量分光光度計檢測并計算提取的DNA的濃度，將DNA稀釋至終濃度0.05 g/L以用于PCR檢測。使用primer blast軟件來設計覆蓋PRSS1和SPINK1基因7個突變位點的PCR引物，見表1。委托華大基因科技有限公司完成引物合成。

PCR擴增體系：總反應體系10 μL，其中DNA聚合酶(5×106U/L)0.2 μL，10-5mol/L各對引物混合物1 μL，0.05 g/L DNA模板2 μL，2×buffer 5 μL，超純水1.8 μL。置于PE 9700熱循環儀上：94 ℃ 5 min；98 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s -0.5 ℃/Cycle，72 ℃ 1 min，循環20次；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環15次；72 ℃延長5 min。最后4 ℃保存。PCR產物由華大基因科技有限公司測序平臺進行Sanger測序。對于測序中發現的非熱點突變，以CP遺傳風險因素數據庫(http://www.pancreasgenetics.org/index.php)中已知致病突變和可能致病突變認定為HP相關突變，數據庫中未有的突變，在PubMed(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫和ClinVar數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)中查找是否有突變相關報道和致病性分析結果。

表1 PRSS1和SPINK1基因7個突變位點的PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for detection of seven mutation sites in PRSS1 and SPINK1

2 結 果

基因檢測結果顯示，6例患者中有5例檢測出基因突變，其中3例為PRSS1基因雜合性突變，2例患者為SPINK1基因雜合性突變。5例患者的具體情況如下：患者1基因檢測發現有非熱點突變PRSS1 c.455-33 C>T突變，目前未見文獻報道，為內含子突變，來源未知，患有2型糖尿病(圖1A)。患者2基因檢測結果發現有PRSS1 c.235G>A突變，來源于母親，其母有相同PRSS1 c.235 G>A陽性突變，但沒有臨床表現(圖1B)。患者3基因檢測結果發現有SPINK1 c.194+2 T>C突變，來源于父親，其父具有相同SPINK1 c.194+2 T>C陽性突變，但沒有臨床表現(圖1C)。患者4基因檢測結果發現有SPINK1 c.194+2 T>C突變，來源未知，有胰腺炎家族史，其兒子、妹妹以及妹妹的子女均有胰腺炎發作病史，其妹妹檢測到同樣的基因突變(圖1D)。患者5基因檢測結果發現具有PRSS1 c.364C>T突變，來源于其父親，其父亦具有相同的PRSS1 c.364 C>T(p.R122H)陽性基因突變，但沒有臨床表現(圖1E)。患者3和患者5在診斷時無胰腺炎家族史，但是其直系親屬篩查時發現有基因突變攜帶者。

A～E分別為患者1～5圖1 發生PRSS1、SPINK1基因突變5例患者的正向測序圖Fig.1 Forward sequencing results of 5 patients with PRSS1 and SPINK1 mutations

3 討 論

HP臨床表現缺乏特異性，與其他原因導致的AP、CP較難區分。本研究6例患者中5例有腹痛表現，2例有脂肪瀉癥狀，除此之外，HP還有如家族聚集性、發病年齡早(兒童及少年就開始發病)及胰腺癌發病率高等特點，這為憑借臨床表現診斷HP增加了難度。胰腺組織反復炎癥易導致胰腺部分或廣泛纖維化、腺泡萎縮、胰管內結石形成、假囊腫形成，最后進展為CP，并可能伴有不同程度的胰腺內、外分泌功能受損。

PRSS1和SPINK1基因突變或多態性是HP最常見的致病原因。通過對這兩個基因的熱點突變進行檢測，可以快速篩查出HP患者，從而進行早期干預治療[9]。PRSS1基因突變通過改變CTRC依賴性胰蛋白酶激活和降解進一步導致自身活化增強[10]。PRSS1基因突變的患者較早出現胰腺外分泌功能不全和糖尿病[11]。一項針對HP患者及其家族成員以問卷調查形式進行的隊列研究結果顯示，217例攜帶PRSS1基因突變的患者中最常檢測到的突變是p.R122H(83.9%)，其中有37例攜帶PRSS1基因突變患者在研究期間死亡，有5例死于胰腺癌[12]。由于具有胰腺癌變的高風險，因此建議對HP患者進行胰腺惡性腫瘤的主動監測[13]。在日本所進行的一項全國性調查結果顯示，對HP患者及其家庭的基因檢測中41%發現有PRSS1基因突變，36%發現有SPINK1基因突變[9]。我國針對3個HP家系中10例患者和3例散發病例的回顧性分析顯示，3個家系中的HP患者起病年齡為8～46歲，其中<20歲起病7例，>20歲起病3例，以PRSS1基因突變多見，其中1個兩代成員均發病的家系中,存在隨代數延續、發病年齡提前的現象[14]。劉奇才等[15]針對1個HP家系的2例胰腺炎患者的PRSS1基因外顯子進行測序，顯示均為PRSS1基因3號外顯子純合子突變(c.415T>A)。

成人CP的主要病因是過量飲酒，而在兒童中，CP的病因多種多樣，包括基因突變、解剖異常和代謝紊亂等。ORACZ等[16]針對265例CP患兒的臨床資料進行分析顯示，有41例患兒被診斷為HP(15.5%)，診斷為HP患兒中88%家族史呈陽性，并伴隨PRSS1基因突變。相比非HP患兒，患有HP的兒童臨床表現更為嚴重。特發性CP患兒應考慮到遺傳原因，即使患兒沒有陽性家族史。一項研究報告了1例13歲的特發性CP男孩，在幼兒期就存在不明原因的胰腺炎發作史，基因檢測發現其攜帶了PRSS1基因的c.623G>C(p.G208A)突變和CTRC基因的c.180C>T(p.G60G)突變，為雜合狀態；對其家庭成員進行基因檢測顯示，其母親為這兩種基因突變的攜帶者，但無臨床癥狀，其外祖母也發現有PRSS1的p.G208A突變[17]。本研究的3例兒童患者中，其父親或母親也均檢測出相同的基因突變，為突變攜帶者，但無相關臨床表現。由于HP是一種復雜的遺傳性疾病，受到環境和遺傳因素相互作用的影響，本研究中的3例患兒可能受其他未知風險因素的影響，而這些因素可能在其父母身上發揮的影響不大。推測基因突變的攜帶者或許可通過改變生活方式、合理飲食等措施，積極預防胰腺炎的發生。

由于PRSS1和SPINK1基因突變的比例很高，為了正確評估CP、RAP和HP患者，即使那些沒有明顯的胰腺炎易感因素或家族史的患者，也應該考慮進行基因檢測[18]。目前對HP的研究一般都是全基因組外顯子測序，費用大、耗時長。本研究通過Sanger測序分析對符合HP篩查條件的6例胰腺炎患者的SPINK1、PRSS1基因外顯子進行測序，結果發現2例為SPINK1 c.194+2 T>C突變，1例為PRSS1 c.235 G>A突變，1例為PRSS1 c.364 C>T突變以及1例為PRSS1 c.455-33 C>T突變。本研究僅僅針對了6例HP高危患者進行了Sanger測序，即有5例檢查出基因突變，提示該檢測方法的陽性率還是比較高的。另外本研究檢測到的PRSS1 c.455-33 C>T突變之前未見相關報道，PRSS1 c.235 G>A突變為首次在中國人群中發現。對于新發現的突變位點可以繼續進行迷你基因檢測，探索與非編碼RNA的相關性以及致病性等。對于未檢出常見基因突變的患者，可以考慮進行耗時更長、花費更大的二次基因檢測，如對已發現的HP基因外顯子靶向測序或全部基因外顯子測序。

綜上所述，在HP高危人群中利用PCR擴增聯合Sanger測序法檢測PRSS1和SPINK1基因的7個熱點突變，能快速、高效地發現HP相關的遺傳基因突變位點，操作簡便，有利于大規模人群篩查，收集高危人群流行病學數據，為完善HP診斷流程尋找參考依據。及早發現上述基因突變攜帶者，進行科學管理，可以有效預防CP發作、胰腺功能損傷，有利于預防癌變，提高患者生活質量。同時，對于那些沒有明顯的胰腺炎易感因素或家族史的患者，也建議進行基因檢測，及早發現病因，并及時干預治療，改善患者預后。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

倫理批準和知情同意：本研究涉及的所有試驗均已通過青島大學附屬醫院醫學倫理委員會的審核批準(文件號QYFYWZLL26902)。受試對象或其親屬已經簽署知情同意書。

EthicsApprovalandPatientConsent： All experiments involved in this study have been reviewed and approved by The Medical Ethics Committee of The Affiliated Hospital of Qingdao University (Approval Letter No. QYFYWZLL26902). Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者貢獻：李曉宇、雷珂、王玲珍參與了研究設計；張文清、魏宏云、王彩霞和陳志紅參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文。

Contributions： The study was designed byLIXiaoyu,LEIKe,andWANGLingzhen. The manuscript was drafted and revised byZHANGWenqing,WEIHongyun,WANGCaixia, andCHENZhihong. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.