脂肪酸結合蛋白4在卵泡液局部的作用及其機制探討

(青島大學附屬醫院生殖醫學科，山東 青島 266003)

脂肪酸結合蛋白4(FABP4)是一種小分子脂質結合蛋白，主要在脂肪細胞、巨噬細胞中表達并分泌[1-2]；其功能是可逆地結合脂質并將其運輸到細胞中特定的細胞器，如線粒體、過氧化物酶體、細胞核和內質網[3]，進而參與調控脂質代謝、炎癥反應、自身免疫反應和氧化應激過程[4-6]。卵泡液在卵泡發育至成熟竇卵泡的過程中逐漸積聚，由免疫細胞、細胞因子、活性氧、脂質、激素等多種物質組成[7]。目前研究認為，卵泡液中炎癥因子以及活性氧自由基(ROS)參與不同階段的卵泡發育、卵母細胞成熟過程[7-9]。FABP4作為炎癥、氧化應激和脂代謝共同遞質，目前在女性生殖領域的研究主要集中在胚胎著床過程，而FABP4是否參與卵泡液局部炎癥反應及脂質代謝過程，尚缺乏相關臨床證據。因此本研究旨在探討FABP4在卵泡液局部環境中主要參與的生理過程，及其對卵母細胞質量的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究納入2020年6月—2021年1月在青島大學附屬醫院生殖醫學科因單純輸卵管和(或)男性因素行體外受精/卵胞質內單精子注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)的女性。排除標準：①存在月經周期紊亂和(或)性激素測定異常；②存在甲狀腺疾病、腎上腺疾病、多囊卵巢綜合征、子宮內膜異位癥；③有惡性腫瘤病史。根據受試者卵泡液中FABP4濃度的百分位數分為3個濃度組：A組(FABP4的濃度≤24.56 μg/L，P0～P25)，B組(24.56 μg/L48.36 μg/L，P76～P100)。

1.2 IVF/ICSI及胚胎培養

所有受試者均采用拮抗劑方案進行促排卵，待雙側卵巢至少2個優勢卵泡的直徑≥18 mm或者3個≥17 mm時，結合雌二醇(E2)水平確定扳機時間，當晚肌注人絨毛膜促性腺激素(hCG)(麗珠醫藥集團股份有限公司)6 000～8 000 U，36～38 h后在陰道超聲引導下穿刺取卵。取卵后4～6 h，根據精液參數或既往受精情況采用常規IVF/ICSI授精。體外受精后，在37 ℃、含體積分數0.06 CO2培養箱中使用G-1medium培養胚胎，18 h后觀察受精情況，72 h后評估胚胎質量：根據形態學參數將早期胚胎分為4級，Ⅰ、Ⅱ級胚胎為優質胚胎[10]。

1.3 觀察指標的收集和卵泡液指標檢測

受試者一般觀察指標，包括年齡、體質量指數(BMI)、胰島素抵抗指數(HOMA-IR)、基礎E2、基礎孕酮(P)、基礎竇卵泡數(AFC)；促排卵監測指標，包括促性腺激素(Gn)使用總量、hCG注射日E2、hCG注射日P；IVF實驗室指標，包括獲卵數、優質胚胎率；卵泡液觀察指標，包括總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、三酰甘油(TG)、FABP4、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、白細胞介素-6(IL-6)和氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)。其中優質胚胎率=受精后72 h優質胚胎數/2PN胚胎總數×100%。

卵泡液收集和檢測：取卵過程中，第一穿刺卵泡選擇直徑18～22 mm者進行穿刺，并收集第一管無血液污染的卵泡液，采用常溫離心法(1 800 r/min離心8 min)去除細胞沉淀和雜質，留取上清液分裝后于-80 ℃低溫保存待測。采用日立化成診斷系統株式會社提供的LDL-C(選擇性可溶化法)、TC(酶法)和TG(去游離法和酶法)檢測試劑盒，分別檢測卵泡液中LDL-C、TC和TG的濃度，檢測儀器為貝克曼庫爾特AU5821全自動生化分析儀(克曼庫爾特有限公司,美國)，每份樣品均設復孔檢測。采用武漢伊萊瑞特生物有限公司提供的酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒分別檢測卵泡液中FABP4、MCP-1、IL-6和ox-LDL的濃度，檢測儀器為TECAN SUNRISE酶標儀(帝肯公司，瑞士)，每份樣品均設復孔檢測。

1.4 統計學方法

2 結 果

2.1 3組受試者基線數據和實驗室觀察指標比較

本研究共納入符合要求的受試者為122例，其中A組30例，B組62例，C組30例。3組受試者的基線數據，包括年齡、BMI、基礎性激素(E2、P)、hCG注射日性激素(E2、P)、HOMA-IR、AFC和Gn使用總量比較，差異無顯著性(P>0.05)；3組受試者實驗室觀察指標(獲卵數和優質胚胎率)比較，差異無顯著性(P>0.05)。見表1。

2.2 3組受試者卵泡液中相關因子濃度的比較

A、B和C組卵泡液中MCP-1、IL-6、ox-LDL水平隨FABP4濃度增高而增高，組間比較差異有顯著性(H=11.371～54.114，P<0.01)；兩兩比較結果顯示，A組MCP-1、ox-LDL水平均顯著低于B、C組(H=-65.017～-19.447，P<0.01)；A組IL-6水平顯著低于C組(H=-30.633，P<0.01)；并且B組MCP-1、ox-LDL水平均顯著低于C組(H=-36.337、-44.331，P<0.01)；3組受試者卵泡液中LDL-C、TC和TG水平比較差異均無顯著性(P>0.05)。見表2。

表1 3組受試者基線數據和實驗室觀察指標比較Tab.1 Comparison of baseline data and laboratory markers between the three groups

表2 3組受試者卵泡液各因子濃度的比較Tab.2 Comparison of the concentrations of various factors in follicular fluid between the three groups

2.3 影響優質胚胎率的多因素線性回歸分析

將年齡、BMI、AFC、Gn使用總量、hCG注射日E2、hCG注射日P及卵泡液中FABP4、MCP-1、IL-6、ox-LDL、LDL-C、TC、TG共13個自變量納入線性回歸模型，采用后退法篩選自變量。結果顯示，模型中剩余5個自變量，其中卵泡液中FABP4(β=-0.520，95%CI=-0.981～-0.059,P<0.05)，IL-6(β=-0.114，95%CI=-0.212～-0.015,P<0.05)，Gn使用總量(β=-0.008，95%CI=-0.016～-0.001,P<0.05)是優質胚胎率的獨立危險因素，而卵泡液中ox-LDL(β=0.010，95%CI=0.003～0.017,P<0.05)，BMI(β=2.122，95%CI=0.390～3.853,P<0.05)是優質胚胎率的獨立保護因素，5個自變量的方差膨脹因子都小于2，不存在共線性。

3 討 論

研究表明，FABP4是炎癥、脂代謝和氧化應激相關信號通路中共同的調節因子，在多種代謝性和炎癥性疾病中起關鍵作用[11-13]。MCP-1主要由內皮細胞、成纖維細胞和免疫細胞表達，參與單核細胞/巨噬細胞遷移和滲透[14]。IL-6主要由免疫細胞產生，在卵泡發育過程中影響血管通透性以及血管生成[7]。本研究表明，卵泡液中MCP-1和IL-6水平隨FABP4濃度的升高而增高，提示FABP4在卵泡液環境中參與局部炎癥過程。在巨噬細胞和脂肪細胞中沉默FABP4可導致MCP-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子顯著減少[11,15]。目前研究認為FABP4會通過激活IKK-NF-κB以及JNK-AP-1通路促進炎癥發生[16-17]。卵泡液中炎癥因子參與卵巢正常生理過程，包括排卵期的血管生成、類固醇生成、卵母細胞成熟、白細胞浸潤以及卵泡破裂和重塑[18]。因此或許可以認為卵泡液中FABP4可能通過調節炎癥反應參與卵巢正常的生理過程，但還需要進一步研究證實。

ox-LDL是LDL受ROS氧化修飾后的產物，當機體發生ROS和抗氧化系統失衡，過多的ROS會引起脂質過氧化，其中包括LDL，因此ox-LDL可以作為體內氧化應激的標記物[19]。本研究表明，ox-LDL濃度隨FABP4的升高而增高，提示FABP4與卵泡液局部氧化應激可能有關。既往研究表明，FABP4與氧化應激之間存在相互作用，ox-LDL可在多種細胞類型中誘導FABP4表達[17,20]，而在子宮內膜基質細胞和巨噬細胞中，沉默FABP4可降低其氧化應激水平[6,21]。此外，FABP4-/-小鼠體內由ox-LDL誘導產生的MCP-1以及TNF-α表達明顯減少[22]。因此或許可以認為卵泡液中FABP4可能與局部氧化應激有關系，并且ox-LDL可能是部分通過FABP4上調炎癥水平，但具體機制仍需要進一步研究。

FABP4除了是炎癥過程重要的遞質，同時還可調控脂質代謝過程；FABP4可逆性結合脂肪酸并完成其亞細胞器的靶向運輸，脂肪酸隨即轉化并合成TG和TC；TG是大多數生物體重要的能量儲存形式，對卵母細胞和卵巢的發育至關重要；TC是所有類固醇激素的前體，進一步通過酶促反應逐步合成P、睪酮和E2等類固醇激素[8]。FAN等[8]在鵝卵巢顆粒細胞的體外實驗表明，FABP4過表達的顆粒細胞中細胞色素P45011A1(CYP11A1)和細胞色素P45019A1(CYP19A1)mRNA和蛋白水平明顯增高，培養基中P和E2濃度明顯升高，提示FABP4促進類固醇激素合成。臨床試驗也表明，循環血中FABP4與雄激素水平獨立相關[13]。但本研究未觀察到基礎或hCG注射日雌孕激素水平以及卵泡液中TG和TC濃度在不同FABP4濃度分組間的差異。此外，既往研究表明循環血液中FABP4水平的升高與BMI及胰島素抵抗增高、血脂代謝紊亂有關[23]，但本研究中也未觀察到卵泡液中FABP4與HOMA-IR、BMI的關聯性。這種卵泡液中FABP4和循環血液中FABP4的差異可能與卵泡液特殊炎癥環境有關。研究表明卵泡液中MCP-1、IL-6、IL-8、IL-10等炎癥因子水平均高于循環血液中[24]。因此，推測卵泡液中FABP4受局部炎癥環境影響更大，進而可能掩蓋了FABP4在卵巢局部脂代謝和類固醇合成過程中的作用。

優質胚胎率是體現卵母細胞質量的重要IVF實驗室指標，與女性生育力密切相關。生理狀態下，卵泡發育和卵母細胞成熟受到炎癥因子和ROS的調控；而各種病理情況下，過度激活的炎癥反應和氧化應激對女性生育力產生負面影響，但臨床研究結果尚存在爭議[7,9,25]。本研究線性回歸模型表明，卵泡液中FABP4是優質胚胎率的危險因素，且該作用獨立于卵泡液中IL-6、ox-LDL及BMI和Gn使用總量。目前FABP4對卵母細胞質量影響的直接機制研究較少，根據本研究的結果可以推測，卵泡液中FABP4對卵母細胞質量的不利影響可能不限于其與炎癥因子IL-6以及ox-LDL的關聯，FABP4在脂代謝和炎癥反應中作用的具體機制仍有待進一步實驗研究。

綜上所述，本研究結果顯示，卵泡液中FABP4可能是通過與MCP-1、IL-6和ox-LDL的相互作用參與了局部的炎癥反應和氧化應激過程，并且進一步影響卵母細胞質量。此外，本研究并沒有觀察到卵泡液中FABP4與BMI、HOMA-IR和卵泡液中脂代謝指標(TC、TG和LDL-C)存在顯著的臨床關聯，而這可能與卵泡液局部獨特的促炎環境有關。但本研究樣本量有限，結論尚需要多中心研究進一步證實。

利益沖突聲明：所有作者、資助者、作者單位不存在與公眾/個人產生研究客觀性、公正性、經濟利益等方面的利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors, sponsors and Author affiliation disclose no relevant conflicts with the public or individuals in the objectivity, fairness, or financial interest of the research.

倫理批準和知情同意：本研究涉及的所有試驗均已通過青島大學附屬醫院醫學倫理委員會的審核批準(文件號QYFYWZLL26587)。受試對象或其親屬已經簽署知情同意書。

EthicsApprovalandPatientConsent： All clinical experimental protocols in this study were reviewed and approved by The Medical Ethics Committee of The Affiliated Hospital of Qingdao University(Approval Letter No. QYFYWZLL26587). Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者貢獻：劉建新、夏晨參與了臨床試驗設計；夏晨、劉姝含、耿穎春、湯秀明、王琳、劉建娥參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文。

Contributions： The study was designed byLIUJianxinandXIAChen. The manuscript was drafted and revised byXIAChen,LIUShuhan,GENGYinchun,TANGXiuming,WANGLin, andLIUJian′e. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.