糖酵解相關基因與肝細胞癌患者預后關系的研究

(青島大學附屬醫(yī)院肝膽胰外科，山東 青島 266003)

肝癌是世界上最常見的原發(fā)性惡性腫瘤之一。根據(jù)全球癌癥統(tǒng)計的數(shù)據(jù)，肝癌是癌癥死亡的第4大原因[1-3]。肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的原發(fā)性肝癌，與慢性肝病關系密切，HBV感染、HCV感染、酗酒和非酒精性脂肪肝等疾病是主要誘因[4]。

糖類是為機體提供生命活動所需能量的主要物質，腫瘤細胞生長代謝的主要能量也來源于糖的代謝,葡萄糖在體內發(fā)生氧化分解的兩條主要途徑是氧化磷酸化和糖酵解。研究顯示糖酵解能影響腫瘤細胞的生物學行為[5]。細胞通過胞膜上的葡萄糖轉運體(GLUT)將葡萄糖轉運入細胞內，生成丙酮酸，這一過程稱為糖酵解。丙酮酸在缺氧條件下轉化成乳酸，而在有氧條件下經(jīng)線粒體氧化磷酸化代謝后產(chǎn)生能量。腫瘤細胞活性狀態(tài)與其所獲得的能量緊密相關[6]。腫瘤細胞的能量供給與正常細胞不同，即使在氧含量充足的情況下也會優(yōu)先通過糖酵解途徑消耗更多的葡萄糖產(chǎn)生能量，滿足自身的需要，這種現(xiàn)象稱為“Warburg effect”或“有氧糖酵解”[7-8]。

本研究首先通過癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫篩選出HCC組織與正常組織中差異表達的基因，構建HCC中糖酵解相關基因的預后模型；探討糖酵解相關基因與HCC患者生存率的關系；通過在線數(shù)據(jù)庫cBioPortal分析預后模型中基因的突變位點；并通過單因素和多因素分析探討影響HCC預后的獨立因素。

1 材料及方法

1.1 數(shù)據(jù)下載與處理

在TCGA數(shù)據(jù)庫[9](包含有50例正常組織樣本和374例腫瘤組織樣本及377例患者的臨床特征數(shù)據(jù))檢索并下載HCC的RNA表達數(shù)據(jù)和臨床特征信息，利用軟件Strawberry Perl 5.32.0[10]將基因表達數(shù)據(jù)整理成為表達矩陣用于后續(xù)分析。

1.2 基因富集分析

從GSEA(www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)網(wǎng)站的MSigDB(Molecular Signatures Database)數(shù)據(jù)庫[11]中獲得REACTOME_GLYCOLYSIS.gmt基因集作為參照基因集，利用基因富集分析(4.1.0版本)軟件分析正常組織與腫瘤組織的基因與糖酵解途徑的富集程度，按照基因富集分析軟件默認參數(shù)，隨機組合1 000次進行富集分析。按矯正后的P值(FDR)進行排序，并將FDR<0.05的基因集作為顯著富集基因集，也就是糖酵解相關基因集。

1.3 構建糖酵解相關基因的預后模型并進行生存分析

使用軟件Strawberry Perl 5.32.0提取糖酵解相關基因的表達量，構建表達矩陣，進行正常組織和腫瘤組織的差異分析，獲得差異表達的糖酵解相關基因；對表達矩陣進行單因素和多因素Cox回歸分析，構建預后模型，獲得與HCC患者預后密切相關的糖酵解相關基因，為預后相關糖酵解基因。使用R4.0.2軟件對預后相關糖酵解基因及377例HCC患者的臨床特征進行生存分析，并依據(jù)基因風險評分將患者分為高風險組、低風險組，繪制ROC曲線，獲取曲線下面積(AUC)。

1.4 糖酵解相關基因預后分析

使用R4.0.2繪制預后相關糖酵解基因的表達熱圖以及風險評分與患者生存時間的模式圖，并進行單因素和多因素的獨立預后分析。使用R語言在TCGA數(shù)據(jù)庫中對預后相關糖酵解基因進行差異表達分析；繪制預后相關糖酵解基因與腫瘤臨床分級的生存曲線。根據(jù)患者年齡及腫瘤分級、分期進行分層分析，將患者分為不同類別的亞組，繪制預后相關糖酵解基因與不同亞組的生存曲線。使用在線數(shù)據(jù)庫cBioPortal(www.cbioportal.org)[12]分析預后相關糖酵解基因的突變類型以及突變率。

1.5 組織標本的獲取以及預后相關糖酵解基因的檢測

收集青島大學附屬醫(yī)院肝膽胰外科行肝癌部分肝切除術的30例HCC患者的腫瘤組織及癌旁正常組織標本，使用RNAiso plus試劑盒(日本TaKaRa公司)提取兩種組織標本中的總RNA以后，采用PrimeScript TM RT Reagent Kit(日本TaKaRa公司)將總RNA逆轉錄成互補DNA(cDNA)。后在LightCycler 480上使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme，中國)進行實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測預后相關糖酵解基因的相對表達量，使用軟件graphpad 8.0 進行組間比較的t檢驗分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 正常樣本和腫瘤樣本的基因富集分析

將TCGA數(shù)據(jù)庫中下載的424例樣本的RNA表達數(shù)據(jù)和MSigDB數(shù)據(jù)庫中獲得的糖酵解相關基因集作為原始數(shù)據(jù)進行基因富集分析顯示，正常組織與腫瘤組織的基因均與糖酵解途徑密切相關。

2.2 篩選HCC中糖酵解相關基因并構建預后模型

使用軟件Strawberry Perl 5.32.0分析篩選出正常組織和腫瘤組織中差異表達糖酵解相關基因42個，進行單因素及多因素Cox回歸分析，構建預后模型，顯示B3GAT3、NDC1、KIF20A3個基因與HCC預后密切相關，為預后相關糖酵解基因。

2.3 糖酵解相關基因驗證與HCC預后分析

通過R4.0.2軟件結合患者的臨床特征對高風險和低風險組患者進行生存分析顯示，低風險組患者的總體生存時間顯著長于高風險組(P<0.001)，繪制的ROC曲線的AUC值為0.691。對預后相關糖酵解基因繪制表達熱圖顯示，B3GAT3、NDC1、KIF20A隨著基因風險評分增大，基因表達隨之增高；同時隨著基因風險評分升高，患者的生存時間顯著縮短。單因素以及多因素的獨立預后分析顯示，患者的腫瘤分期(HR=1.68，95%CI=1.37～2.06,P<0.05)、風險評分(HR=1.10，95%CI=1.06～1.13,P<0.05)是影響患者預后的獨立危險因素。見圖1A、B。

A：預后相關糖酵解基因的單因素獨立預后分析，B：預后相關糖酵解基因的多因素獨立預后分析

圖1 預后相關糖酵解基因的獨立預后分析

Fig.1Independentprognosticanalysisofprognosis-relatedglycolyticgenes

2.4 患者的臨床特征和預后相關糖酵解基因的分層分析

使用R語言比較B3GAT3、NDC1、KIF20A在TCGA數(shù)據(jù)庫中正常組織和腫瘤組織中的表達差異情況，結果示3個基因在腫瘤組織中的表達均顯著上調(P<0.05)。通過生存曲線對B3GAT3、NDC1、KIF20A與臨床特征的相關性進行分析，發(fā)現(xiàn)高表達B3GAT3、NDC1、KIF20A的HCC患者腫瘤分期較差(圖2A)。根據(jù)患者的年齡、分級、分期進行分層分析，將患者分為不同類別的亞組，即年齡>60歲亞組和年齡≤60歲亞組，G1和G2級亞組、G3和G4級亞組、T1和T2亞組、T3和T4亞組，Ⅰ期和Ⅱ期亞組，Ⅲ期和Ⅳ期亞組，繪制糖酵解相關基因與不同亞組的生存曲線顯示，在不同類別的亞組當中，低風險組患者的生存期明顯長于高風險組患者(圖2B～I)。

2.5 B3GAT3、NDC1及KIF20A突變的相關性研究

基于cBioPortal數(shù)據(jù)庫對3個基因在HCC組織中的突變情況進行分析，結果顯示，3個基因均可發(fā)生突變，其中B3GAT3發(fā)生擴增、深度缺失和錯義突變的突變率為1.1%，NDC1發(fā)生擴增和錯義突變的突變率為0.6%，KIF20A發(fā)生擴增和錯義突變的突變率為0.8%。

2.6 組織標本中基因的檢測結果

對我院30例HCC患者的腫瘤組織及癌旁正常組織標本進行RT-qPCR檢測，結果顯示與癌旁正常組織相比較，HCC組織中B3GAT3、NDC1、KIF20A均顯著高表達(t=2.156～2.696)。詳見表1。與對TCGA數(shù)據(jù)庫中信息進行分析所獲得的結果一致。

表1 組織標本中預后相關糖酵解基因的差異表達Tab.1 Differential expression of prognosis-related glycolytic genes in tissue specimens

3 討 論

HCC是最常見的消化道惡性腫瘤之一，占全球惡性腫瘤發(fā)病率的第6位，其死亡率居第4位。雖然手術切除、放射治療、化療和肝移植等治療方法日益完善[13-14]。但是，由于HCC不易早期發(fā)現(xiàn)、術后5年復發(fā)率高，患者預后均較差[15]。因此發(fā)現(xiàn)HCC潛在的診斷和預后標志物至關重要[16]。

正常情況下，糖酵解是機體缺氧時獲得能量供應的主要途徑。在腫瘤細胞中會出現(xiàn)與正常細胞不同的代謝變化。有研究認為，腫瘤細胞的糖酵解增加，是腫瘤細胞惡變最基本的變化之一[17-18]。惡性腫瘤的代謝以Warburg效應為特征，即腫瘤細胞的代謝由線粒體的氧化磷酸化向糖酵解轉變[19]。雖然有氧糖酵解產(chǎn)生ATP的效率不如氧化磷酸化，但有氧糖酵解可增加還原型輔酶Ⅱ(NADPH)的合成和氧化防御，與腫瘤細胞的生長以及生存密切相關[20-21]。腫瘤和糖酵解的相關性已成為當前的研究熱點，但目前對糖酵解相關腫瘤生物標志物的研究較少[22]。因此該領域成為當前的研究熱點，而且糖酵解相關生物標志物也不斷被發(fā)現(xiàn)并研究[23]。

A：預后相關糖酵解基因與腫瘤分期的生存分析，B：預后相關糖酵解基因在年齡>60歲亞組的生存分析，C：預后相關糖酵解基因在年齡≤60歲亞組的生存分析，D～I：預后相關糖酵解基因在G1和G2級亞組、G3和G4級亞組、T1和T2亞組、T3和T4亞組、Ⅰ期和Ⅱ期亞組、Ⅲ期和Ⅳ期亞組的生存分析圖2 臨床特征和預后相關糖酵解基因的預后分層分析Fig.2 Prognostic stratification analysis of glycolytic genes associated with clinical features and prognosis

以往研究表明，糖酵解相關基因UCP2能促進胰腺癌細胞的增殖，影響胰腺癌的發(fā)生發(fā)展，可作為胰腺癌診斷的潛在生物標志物[24],但在HCC中糖酵解相關腫瘤標志物的研究尚不充足。為了研究HCC中預后相關糖酵解基因，本研究通過生物信息學分析的方法，首先篩選出糖酵解相關基因，構建了預后模型，獲得預后相關的糖酵解基因(B3GAT3、NDC1、KIF20A)，對預后相關糖酵解基因進行基因風險評分及生存分析發(fā)現(xiàn)，隨著基因風險評分的增大，患者的生存時間縮短，生存率降低，因此提示B3GAT3、NDC1、KIF20A可能是與HCC患者預后密切相關的潛在生物標志物。

B3GAT3是葡萄糖醛酸轉移酶基因家族的一員，該基因產(chǎn)物通過葡萄糖醛基轉移反應催化糖胺聚糖-蛋白質連接的形成[25]。有研究檢測透明細胞癌組織中B3GAT3的表達水平，結果發(fā)現(xiàn)與對照組相比B3GAT3在透明細胞癌中呈現(xiàn)出顯著高表達，生存分析發(fā)現(xiàn)高表達B3GAT3患者的平均生存期明顯低于低表達患者，B3GAT3被認為是透明細胞癌的預后評價指標[26]。NDC1是跨膜核孔蛋白的編碼基因。其可在細胞周期、有絲分裂和成熟mRNA的運輸中發(fā)揮作用[27]。以往研究顯示，NDC1在腫瘤組織的表達顯著上調，如食管鱗癌組織、肺癌組織等，并且高表達的NDC1與食管鱗癌、肺癌患者的不良預后顯著相關[28-29]。KIF20A可與三磷酸鳥苷(GTP)結合形式的RAB6A和RAB6B發(fā)生相互作用。可作為RAB6調節(jié)高爾基膜和相關囊泡沿微管運輸所需的馬達。其可在包括細胞周期、有絲分裂和信號轉導等功能中發(fā)揮作用[30]。既往研究顯示KIF20A的表達在膀胱癌中顯著升高，KIF20A高表達患者的平均生存期明顯短于低表達患者[31]。下調KIF20A能有效抑制HCC細胞的增殖，增加其G1期阻滯作用，因此KIF20A可能作為HCC患者生存的預后生物標志物和潛在的治療靶點[32-33]。

綜上所述，本研究通過生物信息學方法獲得了HCC中與預后密切相關糖酵解基因，進一步分析顯示B3GAT3、NDC1、KIF20A高表達與HCC患者的不良預后顯著相關，也許是HCC患者潛在的生物標志物。本研究為HCC預后生物標志物的研究提供了新線索和新思路，為后續(xù)的實驗研究提供了理論參考依據(jù)。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

倫理批準：本研究涉及的所有試驗均已通過青島大學附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的審核批準(文件號QYFYWZLL26976)。所有試驗過程均遵照《人體醫(yī)學研究的倫理準則》的條例進行。受試對象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書。

EthicsApprovalandPatientConsent： All experimental protocols in this study were reviewed and approved by The Medical Ethics Committee of The Affiliated Hospital of Qingdao University (Approval Letter No.QYFYWZLL26976), and all experimental protocols were carried out by following The Ethical Guidelines for Human Medical Research. Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者貢獻：曹景玉、朱呈瞻、李坤、劉奎參與了研究設計；解宇威、劉鵬、徐翔宇、高瑞謙、高雨菲參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions： The study was designed byCAOjingyu,ZHUChengzhan,LIKun, andLIUKui. The manuscript was drafted and revised byXIEYuwei,LIUPeng,XUXiangyu,GAORuiqian, andGAOYufei. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.