78c對膠原誘導性關節炎小鼠的治療效果及其機制

張小鈺 王洪星2 常曉天

(1 青島大學附屬醫院醫學研究中心，山東 青島 266003； 2 山東大學齊魯醫院檢驗科)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種自身免疫性疾病，主要癥狀為關節疼痛、腫脹和僵硬，但其發病機制尚不完全清楚[1]。研究證明，RA患者滑膜組織和外周血中CD38的表達水平明顯升高[2-3]。CD38是一種具有受體和酶功能的細胞表面蛋白，能夠催化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸生成二磷酸腺苷核糖以及環腺苷二磷酸核糖(cADPR)[4]。cADPR是調節細胞鈣流量的第二信使[5]。CD38通過控制細胞外核苷酸穩態和細胞內鈣離子流動，參與腫瘤、免疫和衰老等多種生理病理活動[6]。目前研究發現CD38基因敲除小鼠的膠原誘導性關節炎(collagen induced arthritis，CIA)明顯減輕,提示抑制CD38可以緩解CIA的發生發展[7]。78c即thiazoloquin(az)olin(on)es，屬于噻唑喹啉類有機化合物，是CD38的抑制劑[8]。最新研究發現，78c具有延緩衰老的作用[9],但78c對RA的作用及機制尚不清楚。本研究通過建立CIA模型，并以CD38的抑制劑78c進行治療，探討78c對CIA小鼠的治療作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料和設備

6周齡C57BL/6J雄性小鼠共18只，體質量約為20 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司(許可證號：SCXK 2016-0006)。78c試劑購自美國MedChemExpress公司，雞Ⅱ型膠原蛋白購自美國Chondrex公司，流式抗體購買自美國BioLegend公司，流式細胞儀購自美國ACEA Biosciences公司。

1.2 方法

1.2.1動物分組和處理 18只小鼠適應性喂養1周，飼養溫度控制在20～22 ℃，相對濕度40%～70%。隨機分為正常對照組、CIA對照組和CIA治療組，每組6只小鼠。CIA對照組和CIA治療組小鼠均先進行模型制備，首先將雞Ⅱ型膠原與完全弗氏佐劑等量混合液注射于小鼠尾根部皮內，劑量為每只0.1 mL；2周后，每只再次注射0.1 mL雞Ⅱ型膠原與不完全弗氏佐劑等量混合液進行加強免疫。模型制備成功后，CIA治療組小鼠以20 mg/kg劑量的78c(置于體積分數0.10 DMSO和體積分數0.90玉米油混合液中避光溶解)腹腔注射，每周2次，連續3周；正常對照組、CIA對照組小鼠注射相同劑量的上述DMSO和玉米油混合液，每周2次，連續3周。給藥結束后麻醉各組小鼠，內眥取血法采集各組小鼠外周血。斷頸處死所有小鼠，快速解剖，取出小鼠踝關節備用。

1.2.2小鼠足趾厚度變化的檢測 各組小鼠分別于腹腔注射的第0、4、8、12、16、20天(T0～T20)用游標卡尺測量并記錄小鼠的足趾厚度。

1.2.3小鼠關節組織病理檢查 取各組小鼠踝關節，去除多余肌肉組織后放置于40 g/L多聚甲醛中固定保存。制備石蠟切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察小鼠關節組織病理學變化。

1.2.4小鼠外周血中淋巴細胞亞型的檢測 抽取各組小鼠外周血，裂解紅細胞后離心以沉淀白細胞，采用PBS重懸細胞，加入流式抗體，用流式細胞儀檢測各淋巴細胞亞型，并且計算各細胞亞型占淋巴細胞的比例。

1.2.5小鼠血清中Th1/Th2的檢測 分離各組小鼠血清，流式細胞儀檢測小鼠血清中IFN-γ、IL-6、IL-10、TNF-α水平。Th1細胞主要分泌IFN-γ、TNF-α等，Th2主要分泌IL-4、IL-10等。根據上述細胞因子濃度計算Th1/Th2(TNF-α/IL-10、IFN-γ/IL-10)比值[10]。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 各組小鼠足趾厚度變化比較

時間、組別對小鼠足趾厚度有明顯影響(F時間=5.85，F組別=75.14，P<0.05)，時間與組別交互作用對小鼠足趾厚度沒有明顯影響(F交互=1.83，P>0.05)。CIA對照組不同時間點足趾厚度比較差異無顯著性(P>0.05)；正常對照組、CIA治療組不同時間點足趾厚度比較差異均有顯著性(F=16.19、7.73，P<0.05)；相同時間點各組間比較差異均有顯著性(F=27.10～52.83，P<0.05)。見表1。

2.2 各組小鼠關節組織病理學變化比較

正常對照組小鼠關節腔內干凈，軟骨細胞形態結構正常，滑膜未見明顯增生(圖1A)；CIA對照組小鼠滑膜增生明顯，組織中可見較大量的炎性細胞浸潤(圖1B)；CIA治療組小鼠滑膜增生程度減輕，組織中炎性細胞浸潤明顯減少(圖1C)。

2.3 各組小鼠外周血中各細胞亞型占淋巴細胞比例比較

各組小鼠外周血中的B細胞、NK細胞、CD38+NK細胞、Treg細胞占淋巴細胞比例的比較差異有顯著性(F=4.15～10.50，P<0.05),CD3+T細胞、CD4+T細胞占淋巴細胞比例比較差異均無顯著性(P>0.05)。與正常對照組相比較，CIA對照組小鼠B細胞、NK細胞、CD38+NK細胞比例升高(P<0.05)，Treg細胞比例降低(P<0.05)；與CIA對照組相比，CIA治療組小鼠NK細胞以及CD38+NK細胞比例降低(P<0.05)，Treg細胞比例升高(P<0.05)。見表2。

2.4 各組小鼠血清中Th1/Th2比值比較

各組小鼠血清中Th1/Th2比值比較差異有顯著性(F=7.67、16.33，P<0.05)。CIA對照組與正常對照組血清中Th1/Th2比值比較差異有顯著性(P<0.05)，CIA治療組與CIA對照組血清中Th1/Th2比值比較差異有顯著性(P<0.05)。見表3。

表1 各組小鼠足趾厚度隨時間變化比較Tab.1 Comparison of toe thickness changes over time of mice in each group (d/mm, n=6,

表2 各組小鼠外周血中各細胞亞型占淋巴細胞比例比較Tab.2 Comparison of the proportion of each cell subtype in lymphocytes in the peripheral blood of mice in each group

A：正常對照組，B:CIA對照組，C：CIA治療組，HE染色法，200倍圖1 光鏡下各組小鼠踝關節組織病理學變化Fig.1 Histopathological changes of ankle joint of mice in each group under light microscope

表3 各組小鼠Th1/Th2比值比較

3 討 論

RA是一種以多關節炎為主要臨床表現的慢性自身免疫性疾病，全球患病率為0.2%～1%[11]。CIA模型是臨床上常用的RA模型，其足趾腫脹厚度是反映關節炎癥的常用指標[12]。本研究結果顯示，CIA治療組小鼠足趾厚度顯著低于CIA對照組，這表明經78c治療后，小鼠關節炎癥得到緩解，對于CIA可能有保護作用。病理檢查同樣是診斷CIA的指標之一[13]。本研究結果顯示，CIA對照組小鼠關節腔內有壞死、脫落的組織塊，伴有炎性細胞浸潤，滑膜明顯增生，CIA治療組小鼠滑膜細胞增生減少，滑膜組織炎性細胞浸潤明顯減少，提示78c亦可以保護關節組織結構，減輕關節組織炎癥反應，對CIA小鼠發揮了保護作用。

有研究表明，NK細胞既可以通過調節骨代謝，介導骨侵蝕[14]，又可通過影響分泌TNF-α、IFN-γ等細胞因子調節B細胞以及T細胞等免疫細胞參與RA的進展[15]。CD56是NK細胞重要的標志物，有研究發現CD38+CD56+細胞在RA患者外周血中比例顯著提高[16]。本研究結果顯示，CIA對照組與正常對照組相比，小鼠外周血中NK細胞比例升高；CIA治療組與CIA對照組相比，小鼠外周血中NK細胞比例降低。提示NK細胞可能在CIA的進展中發揮促進作用，經78c治療可以緩解炎癥反應。CD38廣泛表達于各種免疫細胞中，參與T、B細胞以及NK細胞的信號轉導、調節細胞的生長增殖和分化、誘導細胞因子的產生[5]，并且在促進NK細胞的活化中發揮重要作用[17]。最新研究報道，CD38+NK細胞可以啟動多發性骨髓瘤患者的免疫系統，并發揮重要的治療作用[18]。CD38+NK細胞在RA發生發展中也發揮著重要作用。CD38+NK細胞在CIA和RA中的比例均增加[16,19]，這提示CD38+NK細胞參與了RA和CIA的發病過程。WANG等[19]研究發現CD38天然抑制劑矢車菊素-3-O-葡萄糖苷可以通過抑制CD38+NK細胞比例緩解大鼠CIA的進展。本研究結果顯示，CIA對照組與正常對照組相比，小鼠外周血中CD38+NK細胞比例顯著升高；CIA治療組與CIA對照組相比，小鼠外周血中CD38+NK細胞比例顯著降低，提示78c具有降低CD38+NK細胞比例、緩解CIA進展的作用。Treg細胞僅占外周血中CD4+T細胞的5%～10%，但在維持機體免疫耐受中發揮重要的作用，是免疫穩態的重要調節因子，通過抑制炎癥反應、促進自身耐受來調節免疫反應[20]。在多種自身免疫性疾病中觀察到Treg細胞比例降低以及功能受損[21]。RA中Treg細胞比例顯著降低，并與RA的活動程度呈負相關[22-23]。許多研究指出，提高Treg細胞比例或修復Treg細胞功能是治療自身免疫性疾病的有效策略[21,24]。LI等[25]也曾觀察到外源性Treg細胞治療CIA模型大鼠后，關節炎癥明顯減輕。本研究結果顯示，CIA對照組與正常對照組相比較，小鼠外周血中Treg細胞比例顯著降低；CIA治療組與CIA對照組相比較，小鼠外周血中Treg細胞比例顯著升高。提示78c可能通過提高Treg細胞比例，對CIA發揮保護作用。

在RA患者活動期，血清中某些致炎細胞因子如IFN-γ、IL-6、TNF-α水平明顯高于健康人，這些致炎細胞因子在滑膜病變中起決定作用，并在病情緩解期或治療后水平明顯降低；而抗炎因子如IL-10水平顯著低于健康人，可以起到加劇關節損傷的作用[26]。Th1細胞主要介導細胞免疫應答，分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α等細胞因子；Th2細胞介導體液免疫，主要分泌IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等細胞因子[27]。其中IL-10被認為具有雙向免疫作用，其免疫抑制功能主要表現在抑制Th1細胞分泌的IFN-γ和IL-2，使Th1、Th2處于免疫平衡狀態[28]。另一方面可對T、B淋巴細胞產生免疫反應，在RA疾病過程中具有保護作用。研究顯示，Th1/Th2比值失衡促進了自身免疫性疾病的發生發展[29]。在活動性RA中，Th1細胞和Th2細胞間的平衡被破壞[30]。WANG等[31]利用CD4+T細胞與CD38+NK細胞共培養模型發現，CD38抑制性抗體可以通過CD38+NK細胞調節Th1/Th2細胞的平衡。本研究結果顯示，CIA對照組與正常對照組相比，小鼠Th1/Th2比值升高；CIA治療組與CIA對照組相比，小鼠Th1/Th2比值降低，由此可以推測78c可能通過恢復Th1/Th2細胞的平衡，緩解CIA小鼠的關節損傷。

綜上所述，本研究結果顯示，CD38的化學抑制劑78c可以顯著緩解CIA關節炎癥，其作用機制可能與降低CD38+NK細胞比例、升高Treg細胞比例，恢復Th1/Th2細胞的平衡有關。CD38抑制劑在改善RA關節損傷方面有良好臨床應用前景，其確切的機制還有待進一步深入研究。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

倫理批準和動物權利聲明：本研究涉及的研究對象均已通過青島大學附屬醫院醫學倫理委員會的審核批準(文件號QYFYWZLL266-23)。實驗動物遵照《中華人民共和國實驗動物管理條例》的規定飼養和處理。

EthicsApprovalandAnimalRight： The subjects involved in this study were reviewed and approved by The Ethics Committee of The Affiliated Hospital of Qingdao University (Approval Letter No.QYFYWZLL26623). The experimental animals were kept and handled in accordance with the provisions of the Regulations of the People’s Republic of China on the Administration of Experimental Animals.

作者貢獻：常曉天參與了研究設計；張小鈺、王洪星參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文。

Contributions： The study was designed byCHANGXiaotian. The manuscript was drafted and revised byZHANGXiaoyuandWANGHongxing. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.