人NK細胞的體外擴增及其基因表達通路的研究

張紅 吳昊2 姜磊2 魯曉晴

(1 青島大學公共衛生學院，山東 青島 266071； 2 青島大學華賽醫學細胞和蛋白質藥物研究院)

自然殺傷(NK)細胞是機體重要的先天性免疫細胞，也是抵御病毒感染或者惡性腫瘤的第一道防線[1]。NK細胞主要分布在外周血中，占外周血單個核細胞(PBMC)的比例為5%～20%，在腫瘤患者體內，其抗腫瘤免疫的作用會受到限制[2-3]。因此必須在體外擴增培養大量有活性的NK細胞以滿足患者臨床治療的需要。

研究表明，細胞因子對NK細胞影響各不相同，多細胞因子聯合應用能更好促進NK細胞增殖和活化[4-9]。然而如何對影響NK細胞增殖活化的因素進行選擇和優化，從而達到最佳效果，迄今為止，尚無一致結論。本研究首先從NK細胞的擴增數量、表型以及功能實驗等方面對NK細胞體外擴增方法進行驗證，以期為NK細胞免疫治療提供理論基礎和實驗依據；然后再通過磁性細胞分選(MACS)技術獲得不同培養階段純化后的NK細胞，進行轉錄組測序(RNA-seq)分析[10-11]，進一步探討NK細胞體外增殖活化的信號通路，為基于NK細胞藥物的開發提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料和設備

人淋巴細胞分離液購于美國Alere公司，IFN-γ ELISA試劑盒購于美國R&D生物科技公司，重組人IL-2(rhIL-2)、rhIL-12、rhIL-15、rhIL-18、rhIL-21和抗人CD16單克隆抗體均為同立海源生物科技有限公司產品；鼠抗人CD56、CD3流式抗體購于美國BD公司，免疫磁珠、分選器以及分選柱均購于德國Miltenyi公司，腫瘤細胞株K562-GFP購買于美國ATCC細胞庫。

1.2 細胞培養

選取健康志愿者6例(健康體檢者，男女不限，年齡18～45歲)，每例志愿者均無菌采集外周血50 mL作為樣本，分離PBMC，每例樣本的PBMC分別使用包被過CD16抗體的T25細胞培養瓶以密度1.5×109個/L進行培養，并且每瓶均加入5 mL人淋巴細胞無血清培養基(含體積分數0.05的人滅活自體血清，以及體積分數0.001的rhIL-2、體積分數0.003的rhIL-12、體積分數0.002 5的rhIL-15、體積分數0.005的rhIL-18、體積分數0.001的rhIL-21)；每2～3 d補充上述培養液一次，并在第0、3、5、7、10和14天時對每例樣本的培養液在倒置顯微鏡下觀察細胞的擴增情況；分別于第0、10、14天收集每例樣本的細胞進行后續表型和功能實驗的檢測。采用含體積分數0.10 FBS的RPMI 1640培養基于37 ℃、含體積分數0.05 CO2培養箱中對腫瘤細胞株K562-GFP進行傳代培養，取生長旺盛的細胞備用。

1.3 流式細胞術檢測NK細胞表型

收集每例樣本培養第0、10、14天的細胞，并將細胞密度調整為1×109個/L，將上述細胞熒光標記CD3-APC、CD56-PE抗體，用于流式細胞儀檢測。每個時間點的NK細胞均設置同型的IgG陰性對照，在4 ℃條件下避光孵育20 min后，使用PBS漂洗2次，加入100 μL PBS重懸細胞后，用流式細胞儀檢測和分析NK細胞表型，即CD3-CD56+細胞所占比例。

1.4 NK細胞體外殺傷活性檢測

取生長旺盛的K562-GFP靶細胞懸液進行計數，調整細胞密度為1×108個/L，在12孔板上根據效靶比依次為5∶1、10∶1和 20∶1加入相應細胞密度的NK效應細胞(每例樣本培養第0、10、14天的NK細胞)，同時設置只有K562-GFP靶細胞的對照孔，置于細胞培養箱共培養4 h，收集細胞，采用流式細胞術檢測各組NK細胞的殺傷活性。殺傷活性的計算公式：[(對照組K562-GFP活細胞數-實驗組K562-GFP活細胞數)/對照組K562-GFP活細胞數]×100%。

1.5 ELISA方法檢測不同時間點NK細胞IFN-γ的分泌情況

提取每例樣本培養第0、10、14天的NK細胞，以ELISA方法檢測細胞中IFN-γ的分泌情況，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。每個時間點的NK細胞設置3個復孔，結果取均值。

1.6 純化NK細胞并行RNA-seq和基因富集分析

根據上述對NK細胞進行細胞表型和功能實驗的檢測結果，篩選出最優的3例志愿者樣本，篩選標準為NK細胞純度、殺傷活性以及IFN-γ分泌量均較高者。分別收集這3例最優志愿者體外培養第0、10、14天的細胞進行MACS，先用CD3磁珠進行陰性分選，再用CD56磁珠進行陽性分選，獲得純化后的NK細胞，即CD3-CD56+細胞，計算NK細胞的純化效率(3例樣本不同時間純化效率的平均值)。對每例樣本每一個時間點純化后的NK細胞分別進行RNA-seq分析，委托北京貝瑞和康生物技術有限公司完成。對RNA-seq結果，以|log2(Fold Change)|>2且P<0.05為標準篩選出不同時間點NK細胞中差異表達基因(DEGs)，并對DEGs進行GO功能和KEGG通路富集分析。

1.7 統計學分析

2 結 果

2.1 NK細胞的體外擴增情況以及表型分析

從第1天開始，體外擴增的NK細胞形態發生改變，變亮變圓，逐漸出現抱團聚集現象。NK細胞在培養前5 d生長較為緩慢，最快增殖時間為培養的第7～14天(圖1)。當細胞培養至第10天時，細胞數量達到(37.27±4.29)×106個，當細胞培養至第14天時，細胞的數量達到(48.93±4.43)×106個。使用流式細胞儀分析培養至第0、10、14天時NK細胞(CD3-CD56+)的比例，結果詳見圖2A～C，其中Q1區為NK細胞所在區域，第14天時NK細胞(CD3-CD56+)的比例超過90%。

A～C分別為培養第0、10、14天的NK細胞圖1 NK細胞體外擴增情況Fig.1 In vitro amplification of NK cells

A～C分別為流式細胞儀檢測第0、10、14天時NK細胞(CD3-CD56+)所占比例圖2 NK細胞表型檢測Fig.2 NK cell phenotype

2.2 NK細胞對K562細胞的殺傷活性分析

析因設計的方差分析顯示，時間、效靶比、時間和效靶比交互對NK細胞的殺傷活性均有顯著影響(F時間=4 086.28，F效靶比=2 857.25，F時間*效靶比=341.18，P<0.05)；單獨效應分析顯示，在效靶比相同時，第10天和第14天時NK細胞殺傷活性均較第0天明顯增強，在同一時間點，不同效靶比的NK細胞對K562細胞的殺傷活性比較差異具有顯著性(F=124.40～5 512.00，P<0.05)。見表1。

2.3 不同時間點NK細胞IFN-γ的分泌情況比較

檢測結果顯示，第0、10、14天時NK細胞IFN-γ分泌量分別為(1.42±0.13)、(41.22±1.18)和(45.85±1.23)μg/L，不同時間點比較差異有顯著性(F=1 697.00，P<0.05)，其中第14天與第0、10天時比較差異均具有統計學意義(q=67.17、7.75，P<0.05)。

表1 不同效靶比和不同時間點時NK細胞對K562細胞的殺傷活性比較Tab.1 Comparison of killing activity of NK cells against K562 cells at different effector/target ratios and different time points

2.4 不同時間點NK細胞純化效率

檢測結果顯示，這3例最優志愿者不同時間點的NK細胞經過MACS純化以后，NK細胞(CD3-CD56+)的比例達到(94.69±1.33)%。

2.5 不同時間點NK細胞的RNA-seq分析結果

RNA-seq分析結果顯示，與第0天相比，培養至第10天時NK細胞中上調DEGs有1 458個，下調DEGs有1 748個；與第0天相比，培養至第14天時NK細胞中上調DEGs有1 077個，下調DEGs有1 103個。與第10天相比，培養至第14天時NK細胞中上調DEGs有0個，下調DEGs有4個。GO功能和KEGG通路富集分析結果顯示，這些DEGs主要與炎癥反應、免疫反應、細胞分裂、細胞增殖相關，而且顯著富集在細胞周期、成骨細胞分化、造血細胞調控、NF-Kappa B等信號通路上。

3 討 論

NK細胞活化是指通過IL等外界因子的刺激作用，使NK細胞比作用前具有更強的殺傷活性，從而使機體在抗病毒感染、抗腫瘤和免疫調節等方面發揮重要作用[12]。由于目前對NK細胞活化相關基因組信息的研究有限，導致對NK細胞生長發育和功能調控的許多機制均不明了，限制了其進一步的應用。本研究通過MASC方法獲得純化后不同培養時間的NK細胞并進行RNA-seq分析，篩選出DEGs，為探討NK細胞活化的基因表達通路以及進一步解決臨床應用中所遇到的問題，提供研究方法和手段。

本研究中NK細胞體外擴增情況和表型分析結果顯示，當細胞培養至第14天時，細胞數量達到(48.93±4.43)×106個，NK細胞(CD3-CD56+)的比例超過90%，這表明該培養方法不僅可以有效誘導PBMC成為NK細胞，使其大量增殖并且保證了擴增純度。NK細胞殺傷活性和IFN-γ分泌量檢測結果顯示，第10、14天NK細胞殺傷活性較第0天明顯增強，在同一時間點，隨著效靶比提高，殺傷活性均逐步增強；培養至第14天的NK細胞IFN-γ分泌量均高于第10、0天。這表明該培養方法可以提高NK細胞的殺傷活性和細胞毒作用。本研究建立的NK細胞體外擴增培養方法，無需飼養層細胞，也無需基因改造，就可直接從PBMC中獲得高質量、高殺傷活性和高擴增倍數的NK細胞，從而提高了NK細胞臨床應用的安全性[13-16]。本研究RNA-seq結果顯示，第10、14天NK細胞與第0天NK細胞比較，DEGs均增多，且第10天DEGs多于第14天，表明在現有培養方案下，體外培養至第10天的NK細胞處于增殖活化的關鍵時期，到第14天時NK細胞已經處于平臺期。第10天和第14天NK細胞相比只有4個DEGs，表明這兩組的組間差異較小，樣本間表達模式的相似度較高。GO功能和KEGG通路富集分析結果均顯示，這些DEGs與炎癥反應相關，這表明炎癥反應可能在NK細胞活化發揮作用方面扮演著重要角色。

本研究的創新之處在于首先通過建立NK細胞體外擴增培養方法，比較分析健康人NK細胞在不同時間點的擴增情況、殺傷活性和細胞毒性，探討該培養方法對于NK細胞體外增殖活化不同時期的影響，對未來臨床NK細胞藥物的開發提供參考。此外通過對不同時間點純化后NK細胞進行RNA-seq分析，了解不同培養階段NK細胞的基因表達情況，為后續深入研究NK細胞的特性、探討體外增殖活化潛在的分子調控機制提供了研究方法和研究手段。

目前NK細胞活化的途徑有兩種假說，即“喪失自我”和“壓力誘導”[17-19]。活化的NK細胞通過不同的機制發揮功能，許多研究表明炎癥反應與NK細胞的活化密切相關[20-22]。本研究的GO功能和KEGG通路富集分析結果也顯示這些DEGs與炎癥反應相關，因此本文重點探討和炎癥反應有關的NF-Kappa B信號通路。事實上，通過與炎癥反應相關的細胞因子使NK細胞活化，從而對腫瘤細胞進行殺傷的治療手段已經應用于臨床[23-24]。研究表明NF-Kappa B信號通路的特異性阻斷劑MG132可以部分下調NK細胞的細胞毒活性，并同時抑制NK細胞的增殖，這可能是通過調節IFN-γ、FASL、perforin等殺傷分子的表達從而發揮其調控NK細胞活化的作用[25]。然而，關于調控NK細胞活化的具體細節并不清楚，還需要進一步的探索和研究。

本研究也存在一些局限性，如樣本量較小，無法更好地設置生物學重復，并且只是在生物信息學分析下的理論研究，下一步還應進行一些分子生物學實驗的驗證，從而進一步闡明NK細胞體外活化的具體機制和作用。

綜上所述，本研究從方法學的角度探索CD16抗體聯合5種細胞因子體外擴增培養NK細胞方法的有效性，并在NK細胞擴增數量、表型檢測和功能實驗方面進行驗證，為NK細胞免疫治療提供理論基礎和實驗依據，從而為進一步解決臨床應用所遇到的問題提供研究方法和手段。另外，本研究還通過對不同時間點純化后的NK細胞進行RNA-seq分析，尋找與維持NK細胞增殖活化相關的信號通路,為基于NK細胞藥物的開發提供新思路。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

倫理批準和知情同意：本研究涉及的所有實驗均已通過青島大學醫學部倫理委員會的審核批準(文件號QDU-HEC-2022163)。所有實驗過程均遵照《赫爾辛基宣言》的條例進行。受試對象或其親屬已經簽署知情同意書。

EthicsApprovalandPatientConsent： All experimental protocols in this study were reviewed and approved by The Ethics Committee of Qingdao University Faulty of Medicine (Approval Letter No. QDU-HEC-2022163, and all experimental protocols were carried out by following the guidelines of Declaration Helsinki. Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者貢獻：張紅、魯曉晴、姜磊、吳昊參與了研究設計；魯曉晴、張紅參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文。

Contributions： The study was designed byZHANGHong,LUXiaoqing,JIANGLei,andWUHao. The manuscript was drafted and revised byLUXiaoqingandZHANGHong. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.