石斛酚對大鼠急性心肌梗死保護作用的機制研究

范 斐

（江蘇省中醫院，江蘇 南京 210004）

0 引言

急性心肌梗死（AMI）和隨之而來的心力衰竭是世界范圍內導致死亡和殘疾的主要原因之一［1］。AMI后，減少急性心肌缺血/再灌注損傷（IRI）、挽救存活心肌和限制心肌梗死（MI）范圍的最有效治療方法是及時使用直接經皮冠狀動脈介入治療（PPCI）進行心肌再灌注［2］。然而，自相矛盾的是，心肌再灌注過程本身會導致心肌細胞死亡和心肌損傷，可占最終心肌梗死面積的50%［3］。因此，AMI 后的死亡率和發病率仍然很高，需要新的治療方法來縮小心肌梗死的范圍，防止不利的左室重構，以減少心力衰竭的發生，改善AMI后的臨床結果。

急性IRI 的炎癥反應在決定AMI 大小和隨后的MI后不利的左心室重構方面起著關鍵作用［4］，使其成為改善AMI 患者臨床預后的潛在治療靶點。急性心肌缺血發生在AMI 時，會引起最初的促炎反應［5］，其目的是清除心肌梗死區的壞死細胞碎片，而IRI 加劇了這種促炎反應，并導致了心肌細胞死亡和心肌損傷。越來越多的實驗證據表明，許多不同的參與者參與了炎癥反應，它們被證明與急性心肌缺血的有害影響有關［6］，使它們成為心臟保護的重要治療靶點。

石斛酚是一種天然存在于石斛中的1，2-二苯乙烷（聯芐）。文獻表明，石斛酚具有多種生物活性，如抗癌、抗氧化、抗衰老、抗凝、抗突變、抗痙攣和抗炎［7］。本文通過大鼠AMI模型，觀察石斛酚對心肌梗死范圍（MIS）、血清磷酸肌酸激酶（CPK）、炎癥因子含量及核轉錄因子-kappaB（NF-κB）的影響，初步探討石斛酚抗AMI的作用機制，為其開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

3K15臺式高速冷凍離心機（Sigma）；Bio-rad垂直電泳槽和PCR 儀器；水平電泳槽等。石斛酚購自Sigma公司；CPK試劑盒購自建成生物工程研究所；白介素-1β（IL-1β）、IL-6 和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒購自 R&D 公司；抗體 NF-κB 和 3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）購自Cell Signaling公司；抗體組蛋白H1（Histone H1）和辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗購自Santa Cruz 公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 動物

雄性SD大鼠50只，質量（200±20）g，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，實驗前適應環境1周。

1.3 實驗分組

將 SD 大鼠 50 只隨機分為 5 組，每組 10 只，分別為假手術組、AMI 組、石斛酚高（60 mg/kg）、中（30 mg/kg）、低（15 mg/kg）給藥組，采用尾靜脈注射給藥，假手術組和AMI 組給予等量生理鹽水，每天1 次。

1.4 實驗方法與觀察指標

按文獻方法進行AMI 造模［8］，假手術組僅置縫線而不結扎冠脈。各組分別給藥治療。全程記錄心電圖變化，再灌注2 h 后終止實驗。以戊巴比妥（30 mg/kg）腹腔麻醉，采用腹主動脈插管取血，測量血清CPK，IL-1β，IL-6，TNF-α等生化指標；取血后，分離大鼠心臟，洗凈心腔，去掉心房組織及脂肪等，稱質量，將左心室沿冠狀面切為6 片，浸入氯化硝基四氮唑藍（N-BT）緩沖液中，37 ℃水浴中避光孵育15 min，正常組織染色，缺血組織不染色，用缺血心肌與左心室濕重的比例計算MIS。同時，取缺血區心肌組織（假手術組取供血區心肌組織）進行后續的Western Blotting實驗。

1.5 Western Blotting 法測定大鼠心肌組織中NF-κB蛋白表達

按照胞漿和核蛋白提取試劑盒方法試提取心肌組織胞漿和核蛋白。胞漿蛋白用于NF-κB 和GAPDH 的蛋白表達分析，而核蛋白用于NF-κB 和Histone H1的蛋白表達分析，采用分析軟件（Image J）計算目的蛋白與內參蛋白的灰度比值。

1.6 數據處理及統計

數據處理結果用表示。采用SPSS 進行單因素方差分析，組間用LSD 法進行統計學差異分析，P<0.05表示差異有顯著性。

2 結果

2.1 石斛酚對AMI大鼠MIS及血清CPK活性的影響

模型組與假手術組相比，MIS及血清CPK活性顯著增加（P<0.001），表明AMI 模型建立成功。石斛酚中、高劑量組均能顯著縮小AMI 大鼠的MIS（P<0.01），而石斛酚低、中、高劑量組均能顯著降低血清CPK（P<0.001）活性（見圖1）。

圖1 石斛酚對AMI大鼠MIS及血清CPK活性的影響

2.2 石斛酚對AMI大鼠血清炎癥因子的影響

模型組與假手術組相比，血清TNF-α，IL-1β和IL-6水平均顯著上升（P<0.001），石斛酚中、高劑量能顯著逆轉AMI引起的大鼠血清TNF-α，IL-1β和IL-6水平（P<0.001）（見圖2）。

圖2 石斛酚對AMI大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影響

2.3 石斛酚對AMI大鼠缺血區心肌組織NF-κB激活的影響

模型組與假手術組相比，AMI 大鼠缺血區心肌組織NF-κB（核蛋白）蛋白表達水平顯著升高（P<0.001）。中（P<0.01）、高劑量（P<0.001）的石斛酚降低了NF-κB（核蛋白）蛋白表達水平，但是各組之間NF-κB（胞漿蛋白）蛋白表達水平沒有顯著升高（見圖3）。

圖3 石斛酚對AMI大鼠缺血區心肌組織NF-κB蛋白表達的影響

3 討論

心肌梗死是由于冠心病所致。由于中藥能整體調節機體，并具有作用廣泛、安全性能高的優勢，因此，中藥治療心肌梗死越來越受到重視。

MIS 和心肌特異性酶（如CPK）的存在是評價AMI 心臟損害的重要指標［9］。CPK 廣泛分布于心肌細胞胞漿中，大鼠AMI 后CPK 活性明顯升高。本研究表明，石斛酚能縮小AMI 模型大鼠MIS，降低CPK活性，提示石斛酚對AMI具有心臟保護作用。

急性心肌缺血發生在AMI時，會引起最初的促炎反應，其目的是清除MI 區的壞死細胞碎片。PPCI 后心肌再灌注的開始，加劇了這種促炎反應，并導致了心肌細胞死亡和心肌損傷，在促炎和抗炎修復階段之間的平衡和過渡的紊亂都會加重急性心肌缺血，并導致MI 后不利的左室重構。AMI 后，心臟駐留細胞和循環炎性細胞分泌大量促炎細胞因子，它們通過介導炎癥細胞向MI區的募集，在放大IRI的促炎癥反應方面發揮著關鍵作用。介導AMI 后促炎癥反應的主要細胞因子是IL-1β，抑制其的表達可減少MI的大小并防止不良的左室重構；IL-6發揮促炎和抗炎作用，并在IRI后釋放，循環IL-6水平升高已被證明與急性冠狀動脈綜合征有關［10］；且研究表明壞死的心臟駐留細胞釋放TNF-α和隨后的NF-κB激活誘導AMI后的促炎反應［11］，并且 TNF-α，IL-1β和 IL-6 的激活受NF-κB 的調節。本研究顯示，AMI 大鼠血清TNF-α，IL-1β和IL-6水平顯著上升，NF-κB（核蛋白）蛋白表達水平增加，表明AMI大鼠心肌NF-κB激活，繼而引起炎癥因子釋放。

先前的證據表明，石斛酚可以抑制NF-κB 的活性，從而降低炎癥介質的釋放。此外，在人類肝癌研究中，發現石斛酚能夠抑制NF-κB信號通路的激活，從而改善人類肝癌的進展［12］。本研究發現，石斛酚降低了AMI 大鼠缺血區心肌組織NF-κB（核蛋白）蛋白表達水平，同時改善了AMI大鼠血清炎癥因子表達水平，因此，石斛酚可能通過抑制NF-κB 激活改善AMI大鼠心肌組織炎癥病理過程。

綜上所述，石斛酚能夠減小AMI 大鼠的MIS，降低AMI 大鼠血清CPK 活性，對AMI 大鼠具有保護作用。可能是通過抑制NF-κB 信號通路的激活，進而改善了AMI 大鼠炎性反應對心肌細胞的損傷，從而改善了心臟功能。