芝麻子粒脂肪酸主要組分的近紅外光譜模型建立及特征分析

袁青麗，苗紅梅，馬琴，琚銘，張欣童，張海洋

（河南省特色油料作物基因組學重點實驗室/河南省農業科學院芝麻研究中心，河南 鄭州 450002）

芝麻是我國重要的特色優質油料作物，其子粒含有豐富的不飽和脂肪酸（如油酸和亞油酸）以及木酚素等抗氧化物質，素有“油料皇后”之稱[1～3]。芝麻屬于小子粒作物，采用傳統的子粒品質分析方法往往需要耗費較多的子粒樣本，且測定成本高、周期長。為實現快速、精準地評價芝麻子粒樣本的含油量和脂肪酸主要組分等品質性狀，加快芝麻品質遺傳育種研究進程，建立適于芝麻子粒的無破損、快速精準檢測技術方法十分必要。

近紅外光譜（near-infrared reflectance spectroscopy，NIRS）技術是20 世紀80 年代后期發展起來的一項無損物理分析技術[4，5]。有機化學物質在780～2 526 nm 光譜范圍內的吸收特性表明，不同的物質在NIRS 區會產生不同的光譜。利用NIRS 技術可實現對樣品一種或多種組分的定性和定量分析[6]，目前該技術已在芝麻[7～10]、大豆[11]和油菜[12]等油料作物子粒品質（含油量、蛋白質含量、含水量等）檢測上得到了廣泛應用。在種子脂肪酸組分測定方面，何小三等[13]建立了茶油脂肪酸近紅外模型，各脂肪酸含量Q 值均＞0.6，能夠用于茶油樣品品質的快速測定。李建國等[14]建立了單粒花生脂肪酸近紅外模型，為花生高油酸的篩選提供了很大幫助。王鐸等[15]應用NIRS 技術測定了大豆脂肪酸含量，誤差范圍控制在1.5%左右。在芝麻子粒品質和脂肪酸組成成分分析方面，Sato 等[16]最早采用近NIRS 技術測定了芝麻脂肪酸主要組分，并對近紅外光學圖譜測定和化學法測定數據進行了多線性回歸分析和比較，結果顯示，利用NIRS 技術可以快速測定脂肪酸含量，但是粒色對定標模型的準確性影響較大。前期我們利用NIRS 儀器對黃白和黑褐芝麻子粒的水分、油分和蛋白質含量分別建立了定標模型，并用于芝麻品質性狀遺傳分析。本研究采用NIRS 法，擬進一步進行芝麻子粒脂肪酸組分的快速鑒定。

為建立精準測定芝麻脂肪酸組分含量的NIRS 技術方法，本研究選用116 份代表性黃白芝麻種質材料，采用改進偏最小偏二乘法技術（MPLS），開展了黃白芝麻子粒油酸、亞油酸、棕櫚酸及硬脂酸含量的定標決定系數（RSQ）、標準偏差（SEC）、交互決定系數（RSQV）和交互標準偏差（SECV）等參數比較分析，將氣相色譜法測定值與NIRS 法預測值擬合，建立了精準的芝麻油酸、亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸含量的NIRS 模型。同時，利用構建的芝麻主要脂肪酸組分NIRS 模型，開展了芝麻不同種質中主要脂肪酸組分的變化范圍及其關系分析，以期為今后加快芝麻子粒品質特性分析和遺傳育種相關研究提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

參試芝麻種質為116 份代表性黃白芝麻，來自13 個國家，其中中國99份、印度2份、緬甸2份、墨西哥2份、美國1 份、烏干達1 份、越南1 份、日本1 份、希臘2份、委內瑞拉2 份、土耳其1 份、尼日爾1 份、巴拉圭1份。其粒色涉及白、黃等色，L 值（代表暗亮度）、a 值（代表綠紅度）、b 值（代表藍黃度） 分別為42.03～67.83、4.02～11.32 和16.82～28.12。均由河南省農業科學院芝麻研究中心種質資源庫保存并提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 子粒脂肪酸組分測定

1.2.1.1 氣相色譜法（國標法）。（1）油分提取。各芝麻種質樣本均取成熟子粒10 g 左右，研磨粉碎，采用傳統索氏抽提法提取油分。（2）脂肪酸組分測定。參考劉曉穎等[17]的方法，采用氣相色譜法檢測脂肪酸的主要組成及其含量。氣相色譜條件：色譜柱為HP-88 毛細管柱（100 mm×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度為250 ℃；檢測器溫度為280 ℃；空氣流速為450 mL/min，H2流速為40 mL/min；N2流速為2 mL/min；分流比設定為100 ∶1。升溫程序：初始溫度為180 ℃，以4 ℃/min 升至220 ℃，再以1 ℃/min升溫至240 ℃。進樣量1 μL。

1.2.1.2 NIRS 法。將待測芝麻子粒樣品直接倒入取樣杯中輕輕壓實，蓋上金屬反射板，使用NIRS 儀（法國肖邦Spectra Star XT）進行掃描。掃描參數條件：溫度范圍為10～30 ℃，掃描濕度范圍為30%～70%；波長分辨率：1 nm；掃描次數：12 次。光譜散射前處理方法：標準正態變換（SNV）+去趨勢矯正（detrend）+一階導數（1stderivative）。每份樣品重復測定3 次，計算平均吸收光譜作為試驗數據。

1.2.2 NIRS 檢測模型外部驗證 為進一步驗證定標模型的可靠性，隨機選取芝麻種質20 份，采用已建好的定標模型進行NIRS 檢測。同時，采用氣相色譜法（國標法）測定上述樣本的脂肪酸組分。以氣相色譜法測定結果為標準，利用NIRS 檢測結果對建好的定標模型進行驗證。

1.2.3 數據處理與分析 利用Execl、SPSS 和Origin 8.0 軟件進行數據處理與分析。

2 結果與分析

2.1 芝麻種質子粒的脂肪酸組成及其含量（國標法）

檢測結果（表1）顯示，芝麻子粒的脂肪酸組分包括油酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸、棕櫚油酸、花生酸和亞麻酸，含量分布分別為35.05%～51.79%、31.58%～47.77%、7.17%～11.26%、4.35%～7.26%、0.07%～0.89%、0.45%～0.85%和0.21%～0.54%，平均含量依次為43.87%、40.94%、8.61%、5.45%、0.11%、0.61%和0.29%。表明芝麻子粒脂肪酸的主要組分是油酸、亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸，棕櫚油酸、花生酸和亞麻酸含量均相對較低。

表1 試驗芝麻種質子粒的脂肪酸組分及其含量Table 1 The fatty acid compositions and contents in sesame germplasm tested

根據GB 4882—85，偏度系數=0 時，數據符合標準正態分布，其中偏度系數為正數時屬于左偏，反之為右偏；偏度系數＞1 時，數據不符合正態分布。4 種主要脂肪酸組分的偏度系數值為-0.43～0.76，數據均符合正態分布；棕櫚油酸、亞麻酸含量的偏度系數分別為6.35 和1.90，二者數據均不符合正態分布。

圖2 不同芝麻種質亞油酸含量的分布Fig.2 Distribution of linoleic acid content in different sesame germplasm

圖3 不同芝麻種質棕櫚酸含量的分布Fig.3 Distribution of palmitic acid content in different sesame germplasm

圖4 不同芝麻種質硬脂酸含量的分布Fig.4 Distribution of stearic acid content in different sesame germplasm

對116 份樣本的油酸、亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸含量分布變化進行分析，結果（圖1～4）顯示，油酸和亞油酸含量的峰值分別在44.0%和42.0%左右，棕櫚酸和硬脂酸含量的峰值則集中在8.5%和5.5%左右；且4 種主要脂肪酸組分在116 份樣本中均表現出了明顯的梯度變化，符合標準正態分布特征。

圖1 不同芝麻種質油酸含量的分布Fig.1 Distribution of oleic acid content in different sesame germplasm

2.2 芝麻種質子粒的NIRS 分析

掃描結果（圖5）顯示，在光波800～2 600 nm 范圍內，不同芝麻種質子粒樣品形成的NIRS 曲線趨勢相同，體現了材料的同質性；但不同種質子粒樣品的吸光度峰值并不完全一樣，說明不同樣本間脂肪酸組分存在差異。

圖5 不同芝麻種質子粒近紅外吸收光譜圖Fig.5 NIRS spectra of different sesame germplasm

2.3 NIRS 檢測模型內部交叉驗證

為進一步分析光譜曲線及吸光度峰值與子粒脂肪酸組分含量的關系，采用Unity Scientific program 軟件，使用標準正態變換（SNV）+去趨勢矯正（detrend）+一階導數（1st derivative）光譜處理和改進偏最小偏二乘法技術（MPLS）數據處理對樣本的原始光譜圖進行分析，建立了芝麻子粒油酸、亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸的定標模型。根據理想模型衡量原則[18]，RSQ 和RSQV越接近于1、SEC/SECV 越小，模型越理想。

定標結果（表2）顯示，油酸、亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸的RSQ、SEC、RSQV、SECV、SEC/SECV 分別為0.780～0.986、0.169～0.462、0.562～0.941、0.288～0.713 和0.578～0.728，差異均較大，其中，亞油酸含量的RSQ 和RSQV 最高，SEC/SECV 最小，所建模型相關性最好；油酸含量的RSQ 和RSQV 分別為0.981和0.919，均接近于1，所建模型相關性較好；棕櫚酸、硬脂酸的RSQ 和RSQV 均相對較低，SEC/SECV分別為0.587 和0.727，所建模型相關性相對較差。

表2 NIRS 定標模型參數分析Table 2 Parameter analysis of NIRS calibration model

2.4 NIRS 檢測模型外部驗證

隨機選取芝麻種質20 份，分別采用已建好的定標模型進行NIRS 檢測。同時，采用氣相色譜法（國標法）測定上述樣本的4 種主要脂肪酸組分。以氣相色譜法測定結果為標準，利用NIRS 檢測結果對建好的定標模型進行驗證。

檢測結果（表3）顯示，2 種方法的芝麻種質油酸、亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸含量絕對誤差范圍分別為-1.18%～1.49%、-0.78%～3.10%、-0.49%～0.61%和-1.75%～-1.01%。驗證樣品中，油酸和亞油酸含量較為均勻地分布在回歸線兩側（表6 和7），外部驗證決定系數R2分別為0.948 0 和0.936 8，表明NIRS 檢測數據準確地預測了樣本子粒的油酸和亞油酸含量；硬脂酸含量和棕櫚酸含量外部驗證系數R2分別為0.458 0 和0.662 8，樣品數據較為分散（表8 和9），表明這2 個指標的NIRS 預測值與國標法測定值相關性相對較差。

表3 氣相色譜法與NIRS 法測定的脂肪酸含量比較Table 3 Comparison of fatty acid content between GC-MS and NIRS （%）

圖6 氣相色譜法與NIRS 法芝麻種質油酸含量測定結果的相關分析Fig.6 Correlation analysis of oleic acid content in sesame germplasm between GC-MS and NIRS

圖7 氣相色譜法與NIRS 法芝麻種質亞油酸含量測定結果的相關分析Fig.7 Correlation analysis of linoleic acid content in sesame germplasm between GC-MS and NIRS

圖8 氣相色譜法與NIRS 法芝麻種質棕櫚酸含量測定結果的相關分析Fig.8 Correlation analysis of palimtic acid content in sesame germplasm between GC-MS and NIRS

圖9 氣相色譜法與NIRS 法芝麻種質硬脂酸含量測定結果的相關分析Fig.9 Correlation analysis of stearic acid content in sesame germplasm between GC-MS and NIRS

3 結果與討論

NIRS 技術分析速度快、效率高，當前已廣泛應用于農牧、食品、石油、化工等領域[19，20]。在芝麻[21]、大豆[22]、花生[23]、油菜[12]、亞麻籽[24]、向日葵[25]等油料作物的油分和蛋白質等品質指標檢測方面均有所應用，為育種工作提供了較好的數據支持[26，27]。

芝麻子粒中的脂肪酸主要組分為油酸和亞油酸，占脂肪酸總量的70%以上；其次是硬脂酸和棕櫚酸；棕櫚油酸、亞麻酸和花生酸含量相對較少[28]。為了準確檢測芝麻子粒的脂肪酸主要組分，本研究選擇來自13 個國家的116 份代表性黃白芝麻種質的成熟子粒進行了NIRS 檢測和模型分析，與已有研究[8，29]相比，所用材料來源廣（來自13 個國家）、數量多（116份）、粒色范圍寬（L 值42.03～67.83）[30]，為后期模型應用奠定了基礎。本研究采用傳統索氏抽提法提取子粒油分，應用氣相色譜法檢測脂肪酸組分及其含量，結果顯示，116 份黃白芝麻子粒中，脂肪酸的主要組分為油酸、亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸，含量分布范圍分別為35.05%～51.79%、31.58%～47.77%、7.17%～11.26%和4.35%～7.26%，各指標最高值與最低值差別均較大。表明本研究所用試驗樣本代表性強，有利于構建可靠的檢測模型。芝麻子粒中的油酸、亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸含量較高，而棕櫚油酸、花生酸和亞麻酸含量（均＜1%）相對較低，因此，在進行NIRS 模型構建和評價時針對4 個主要組分進行。

本研究結果顯示，在構建的NIRS 模型中，芝麻亞油酸、油酸、棕櫚酸和硬脂酸含量的RSQ 分別為0.986、0.981、0.898 和0.780。尤其亞油酸和油酸含量的NIRS 模型能夠很好地反映出不同樣本中2 個脂肪酸組分的真實含量，其中亞油酸含量的RSQV（0.941） 最高、SEC/SECV （0.577） 最小，所建模型相關性最好。棕櫚酸和硬脂酸的RSQV 分別為0.748和0.562，SEC/SECV 分別為0.587 和0.727，所建模型相關性較油酸和亞油酸略差，這可能與芝麻子粒中硬脂酸（4.35%～7.26%）和棕櫚酸含量（7.17%～11.26%）較低以及含量在子粒不同部位分布不均勻[31]有關。

選擇20 份芝麻種質樣本，對基于116 份樣本建立的NIRS 模型進行外部驗證，結果顯示，樣本中4種主要脂肪酸組分含量的預測值與國標法測定值的絕對誤差均控制在1.50%以內，表明采用NIRS 模型能夠快速、準確地預測黃白芝麻子粒的主要脂肪酸組成含量。此方法快速提高了脂肪酸含量的測定效率，也為脂肪酸含量高、中、低水平的篩選提供了幫助。