超聲聯合BRAF V600E基因檢測模型在主動監測甲狀腺微小癌侵襲性中的應用

王雨竹，彭 梅，姜 凡，王圣應，劉建軍，陶 堃，楊 楊，何 杰

甲狀腺癌的發病率在全球不斷攀升，其中直徑≤1 cm的甲狀腺微小乳頭狀癌(papillary thyroid microcarcinoma，PTMC)發病率占50%以上[1]。2015年美國甲狀腺協會(American thyroid association，ATA)在《成人甲狀腺結節和分化型甲狀腺癌患者管理指南》中提出，對低侵襲性的PTMC患者可以考慮采用主動監測代替立即手術治療[2]。PTMC的侵襲性特征有甲狀腺腺外侵犯、發生淋巴結轉移及遠處轉移[3-4]。BRAF基因突變是甲狀腺乳頭狀癌最常見的基因突變，而BRAF突變以BRAF V600E基因突變為主。部分研究[5]表明，BRAF V600E基因突變與PTMC的侵襲性有一定相關性。該研究旨在通過結合患者臨床特征、術前超聲檢查、BRAF V600E基因檢測，建立甲狀腺結節侵襲性的風險預測模型，為臨床醫師術前制定更好的治療方案提供依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象收集在中國科學技術大學第一附屬醫院西區頭頸乳腺外科初次行手術治療，并經術后病理證實為PTMC且符合納入標準的患者共264例，男66例，女198例。將2017年10月至2019年4月收集的154例PTMC患者納入模型組，2019年5月至2021年1月收集的110例PTMC患者納入驗證組。納入標準：① 術后病理為單發癌灶；② 具有完整的超聲檢查資料、臨床資料、BRAF V600E基因檢測；③ 手術切除范圍至少為患側腺葉切除+患側中央區淋巴結清掃。排除標準：① 合并其他腫瘤；② 術前超聲檢查資料不完整、未做BRAF V600E基因檢測；③ 未行淋巴結清掃。

1.2 儀器與方法超聲檢查采用GE Logiq E9 超聲診斷儀，L15 探頭，探頭頻率6～15 MHz。檢查者取仰臥位，頭部充分后仰暴露頸前區，做甲狀腺兩側葉、峽部的橫斷面及縱斷面滑動掃查。常規超聲掃查可發現甲狀腺可疑惡性結節，觀察結節位置、測量結節大小、觀察結節邊緣、微鈣化(直徑≤1 mm)、縱橫比、回聲及血流分布情況。對頸部淋巴結進行廣泛掃查，觀察檢出的淋巴結形態、大小、包膜、皮髓質回聲以及與周圍組織關系，觀察其內部及周邊血流分布情況。超聲疑為淋巴結轉移是指淋巴結中出現團塊狀高回聲或無回聲區、點狀強回聲，高回聲內血流信號豐富。超聲疑為腺外侵犯是指結節接觸甲狀腺包膜>25%或甲狀腺包膜的回聲線連續性中斷。

BRAF V600E基因檢測：收集符合標準的石蠟標本，選擇蠟塊中間部分，行10 μm切片，使用武漢友芝公司生產的人類BRAF基因V600E突變檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)進行BRAF V600E 突變檢測，利用實時熒光PCR原理，針對BRAF基因第1799位核苷酸上V600E突變進行定性檢測。嚴格按照使用說明書操作，待反應結束分析收集到的熒光信號，在陰性、陽性對照、內部質量控制均在合適范圍的前提下，600Glu PCR反應液管突變檢測Ct值≥38或無Ct值，樣本為陰性；600Glu PCR反應液管突變檢測Ct值<38，則計算該反應管的△Ct值。若該反應管的△Ct值小于9，則樣本為600 Glu的突變陽性；反之則為突變陰性。

2 結果

2.1 模型組單因素分析結果模型組154例PTMC患者中男36例，女118例。對臨床及超聲特征進行單因素分析，結果顯示，患者性別(P=0.003)、年齡(P=0.005)、腫瘤最大徑(P=0.001)、微鈣化(P=0.001)、超聲疑為腺外侵犯(P<0.001)、超聲疑為淋巴結轉移(P=0.012)、BRAF V600E基因突變(P=0.019)均與PTMC的侵襲性有關，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 模型組多因素Logistic回歸分析將表1中有統計學意義的相關因素納入多因素Logistic回歸分析，結果顯示患者性別、年齡、腫瘤最大徑、微鈣化、超聲疑為腺外侵犯、超聲疑為淋巴結轉移、BRAF V600E基因突變均是PTMC的侵襲性的危險因素。見表2。

表1 單因素分析PTMC患者侵襲性的相關因素

表2 多因素Logistic分析結果

2.3 模型組ROC曲線以侵襲性為縱坐標，分別以超聲指標(腫瘤最大徑、微鈣化、超聲疑為腺外侵犯、超聲疑為淋巴結轉移)、BRAF V600E基因、患者臨床特征(性別、年齡)、超聲指標聯合臨床特征、BRAF V600E基因聯合臨床特征、超聲指標聯合BRAF V600E基因以及三者聯合為橫坐標，繪制ROC曲線評估其對PTMC侵襲性的預測效能(圖1)，其曲線下面積AUC分別為0.754(95%CI：0.678～0.831)、0.581(95%CI：0.491～0.671)、0.677(95%CI：0.592～0.762)、0.795(95%CI：0.725～0.864)、0.694(95%CI：0.612～0.776)、0.780(95%CI：0.709～0.852)、0.813(95%CI：0.747～0.879)。其中三者聯合為橫坐標所繪制的AUC為0.813(95%CI：0.747～0.879)，高于其他指標。超聲指標聯合BRAF V600E檢測及患者臨床特征對PTMC患者侵襲性預測效能最好。

圖1 模型組各指標預測效能

2.4 構建風險預測模型以患者臨床特征、超聲指標、BRAF V600E基因檢測為危險因素構建風險預測模型。將各危險因素進行分類，指定每組的參考值Wij，選擇合適的分組作為基礎風險參考值WiREF，記為0分。結合回歸系數βi，以及各組參考值Wij，計算各組與WiREF之間的距離D。設定常數B為1，計算危險因素每個分類所對應的分值，數值四舍五入取整數，結果見表3。根據結果，將每個危險因素的分值加起來計算總分，范圍為：0～8分。

表3 危險因素賦分

表4 風險預測概率表

同時Hosmer-Lemeshow檢驗結果提示P=0.663，確定系數χ2=5.861。說明模型擬合優度好，預測結果準確可靠。

2.5 驗證組ROC曲線驗證組共納入經病理證實為PTMC的患者110例，其中男性30例，女性80例，26～68(42.4±10.3)歲。將患者數據代入預測模型，計算風險預測概率，以術后病理結果作為金標準，繪制ROC曲線(圖2)。所得AUC為0.774(95%CI：0.685～0.848)，cut-off值為0.450 2，靈敏度為83.3%，特異度為62.9%，模型具有較好的診斷效能。cut-off值為0.450 2，以總分≥5分為預測患者甲狀腺結節有侵襲性可能。圖3所示為一位甲狀腺微小乳頭狀癌伴頸部淋巴結轉移患者的超聲圖像。患者男性，36歲，腫瘤最大徑8 mm，無微鈣化，結節外周區域甲狀腺包膜線連續性中斷，頸部VI區淋巴結內見液性暗區，BRAF V600E基因檢測為突變型。預測模型計算侵襲性的風險為94.3%，預測為有侵襲性，與病理結果相符。

圖2 預測模型在驗證組中的預測效能

圖3 甲狀腺微小乳頭狀癌伴頸部淋巴結轉移的超聲圖像A：甲狀腺橫切面圖；B頸部VI區淋巴結(箭頭所示淋巴結內見液性暗區)

3 討論

PTMC一般生物學行為溫和，一部分患者可能終生不表現出臨床癥狀。越來越多的觀點認為對于低侵襲性的PTMC，可采取主動監測的方法來代替手術切除[2,6-7]。多項研究[8]表明，對于主動監測期間有腫瘤生長或淋巴結轉移的患者，補救手術有良好的效果和預后，同時主動監測組患者的術后并發癥及醫療費用明顯減少。但部分病例具有侵襲性，原發灶常侵出甲狀腺包膜，侵犯周圍組織，淋巴結轉移較早且范圍廣，發生遠處轉移，患者的生存率和預后不佳。因此，對于PTMC侵襲性的預測能為臨床選擇合適的治療方案提供幫助。

研究[9]表明男性、年齡<45歲是PTMC患者侵襲性的危險因素，本研究中女性 ∶男性為3 ∶1，OR值為2.611，年齡<45歲OR值為2.356，同樣驗證了這一點。微鈣化反應出的是病理中砂礫體，是鈣化的一鐘特殊類型，主要是腫瘤生長迅速、血供不足、細胞凋亡，使癌組織內局部形成鈣磷沉積微環境，形成微鈣化。多項研究[10-11]表明微鈣化對甲狀腺良惡性結節的定性診斷有重要意義，超聲發現微鈣化時往往提示為惡性結節。王猛 等[12]通過對575例PTMC患者的超聲特征與頸部淋巴結轉移的相關性分析，認為微鈣化是PTMC患者頸部淋巴結轉移的危險因素，本研究結果與之一致。一般認為腫瘤最大徑越大，其發生侵襲性行為的風險就越高。腫瘤最大徑被認為是影響PTMC進展的獨立危險因素，本研究表明腫瘤最大徑>5 mm是PTMC患者侵襲性的獨立危險因素，該結論與Cheng et al[13]的研究是相吻合的。近年來，應用分子生物學有望解決一些甲狀腺組織診斷難的問題。BRAF V600E基因突變是甲狀腺乳頭狀癌最常見的基因突變類型。研究[14]顯示BRAF基因突變與PTMC的侵襲性密切相關，本研究表明BRAF V600E基因突變型的患者出現侵襲性行為的風險更大。

以上各因素需綜合分析，因此本研究對于每個危險因素，選擇一個合適的分組作為基礎風險參考值，計算出預測模型，并將模型帶入110例驗證組中評估，以總分≥5分為預測患者甲狀腺結節有侵襲性分數，所得AUC為0.774(95%CI：0.685～0.848)，cut-off值為0.450 2，模型具有較好的診斷效能。本研究也存在一些局限性。PTMC中存在多種分子標志物，但本研究并未分析其他分子標志物與PTMC患者不良預后之間的關系，也缺乏未手術的長期觀察結果。對PTMC侵襲性的預測還需要大樣本、多中心、前瞻性研究的證實。