CMAB008單抗陽離子交換層析介質壽命確認

邵順儒 郭清城 侯盛 袁秀珍 徐忠升 范文強 張蕙 朱紅帥 邵景德

摘要：建立CMAB008單抗陽離子交換層析介質壽命確認方案，采用實際生產的工藝參數進行縮小模型試驗，以考察Nuvia S層析介質循環到100次后性能指標是否還滿足層析需要。按試驗方案對Nuvia S層析介質循環到100次，分別在使用前和循環使用20、40、50、70、90次后對層析柱進行柱效測試，以考察隨循環次數的增加，層析介質對層析柱對稱因子、理論塔板數的影響;對循環1、50、51、100次的層析柱進行動態載量測試，以考察洗脫峰的ProteinA殘留、HCP殘留、DNA殘留、毛細管電泳純度、SEC-HPLC純度、活性、得率;以不同上樣量20 g/L（循環8、48、88次）、40 g/L（循環9、49、89次）、80 g/L（循環61、62、63次），不同流速110 cm/h（循環10、50、92次）、149 cm/h（循環61、62、63次）、170 cm/h（循環11、59、93次）上樣以考察陽離子交換層析洗脫峰SEC-HPLC純度、得率。結果表明，使用前和循環使用20、40、50、70、90次后柱效測試中，所有對稱因子、理論塔板數均在可接受的標準范圍內;循環1、50、51、100次的層析柱動態載量測試結果均高于起始動態載量的80%，洗脫峰的ProteinA、HCP、DNA殘留檢測未有增高趨勢，毛細管電泳純度、SEC-HPLC純度、活性以及得率未有下降趨勢;上樣測試結果顯示，洗脫峰的SEC-HPLC純度無明顯變化趨勢，均大于98%，得率均大于85%。這些試驗結果均符合CMAB008原液純化工藝要求。結果證明，Nuvia S層析介質在循環到100次時性能指標沒有下降，可以保證純化CMAB008單抗產品的質量。

關鍵詞：CMAB008單抗;層析介質壽命;縮小模型;性能指標

中圖分類號：R318.08 ??文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）08-0069-04

自1972年基因工程技術問世以來，現代生物工程又經歷飛速發展近50年，新世紀人們把更多的關注投向生物工程產業，使生物工程產業迅速崛起，特別是現代醫藥生物工程產業發展迅速，基因診斷、基因治療、人類基因組計劃、生物芯片、轉基因動物、RNA干擾、基因工程抗體、人源化抗體、治療性疫苗和抗體[1]等成果層出不窮，技術日新月異，令人目不暇接。一大批基因工程藥物如雨后春筍般不斷涌現，給人類健康和疾病治療帶來新的治療模式，社會對生物制品的需求與日俱增。《藥品注冊管理辦法》要求藥品安全、有效、質量可控[2]。生物制品不僅要保證藥品的有效性，同時也不能影響其生產工藝穩定性[3]。在現代化的生物制品生產過程中，在工藝上要經過膜過濾法[4]、色譜法[5-6]、超短時微波加熱法、巴氏消毒法、干熱法、有機溶劑/去污劑（S/D）法和低pH值孵放法[7]等至少2種以上的方法進行病毒的去除/滅活[8-9]，還要經過層析法通過高度的純化得到安全、有效、質量可控的產品。現代的層析技術非常廣泛，層析技術是原液純化的關鍵步驟，通過對收集到的中間產品進行純化以得到符合工藝要求的高純度的生物制品。對于純化技術使用的層析介質的管理目前是藥品監督管理部門日常監督檢查、GMP合規檢查、藥品注冊現場核查關注的重點。層析介質的清洗、儲存、使用次數均需要通過驗證進行確認，這在現行的2010年版GMP附錄生物制品中有明確的要求[10]。層析介質成本昂貴，減少國家有限資源的浪費及降低企業生產成本都需要層析介質反復使用多次，但經過層析介質多次使用，其純化能力會發生改變，使純化效果變差，以致影響層析樣品的質量，造成最終使用的制劑有安全隱患。層析介質的關鍵性能指標主要包括目標產品的純度、收率，動態載量減少，去除目標雜質（內毒素、宿主蛋白和宿主DNA等）的能力，層析柱在使用中的物理性（裝柱高度/上樣柱壓、上樣液的流動速度等）的改變等[11]，因此層析介質的使用壽命需要經過嚴格和科學的驗證，這不但保證了藥品的質量，而且還減少國家有限資源的浪費，同時降低企業生產成本。

本試驗建立CMAB008單抗純化的陽離子交換層析介質壽命確認方案，按方案取相應循環后的陽離子交換層析進行，動態載量測試，陽離子交換層析洗脫峰的ProteinA、HCP、DNA殘留檢測，SEC-HPLC 純度、活性檢測;檢測不同上樣量、不同流速陽離子交換層析洗脫峰SEC-HPLC純度、得率;考察經過100個循環后的層析介質是否仍滿足生產工藝需求，也為其他生物制品的層析介質壽命研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 層析設備及介質 AKTA-avant150層析系統、XK16/40層析柱、Tricorn 10/20層析柱、Nuvia S層析介質。

1.1.2 主要試劑 NaOH、乙酸鈉、乙酸、氯化鈉。按生產工藝的要求配制沖洗液、平衡液、洗脫液、再生液、消毒液、保存液;陽離子交換層析上樣液為筆者所在公司CMAB008產品完成親和層析的中間產品。

1.2 方法

工業化生產時的層板柱內徑400 mm，柱高 700 mm。實際使用時一般裝柱高度160～240 mm。本試驗采用與生產相同的柱高，通過縮小柱直徑的方式，實現線性的模型縮小來測試Nuvia S層析介質的使用壽命，計劃按實際工藝流程，進行100個循環的試驗。前50個循環以XK16/40型號層析柱進行驗證，后50個循環以Tricorn 10/20型號層析柱進行驗證。

在江蘇泰州邁博太科藥業有限公司應用AKTA-avant150層析系統，進行試驗，試驗時間為2017年7—9月。按照和生產工藝相同的參數進行100個循環，每個循環都有完整的步驟：消毒、沖洗、前平衡、上樣、上樣后平衡洗滌、洗脫收集、再生、消毒、保存。第8、48、88次循環層析介質上樣量20 g/L;第9、49、89次循環層析介質上樣量 40 g/L;其他非動態載量測試循環層析介質上樣量80 g/L。線性流速采用工藝流速的上下限及生產流速，其中上下限分別做3組有效數據的驗證循環。第10、50、92次循環流速改為110 cm/h;第11、59、93次循環流速改為170 cm/h;其他非動態載量測試循環流速為生產流速149 cm/h。為了評估Nuvia S層析介質的性能，按設計的驗證方案取樣檢測。每個循環的流程及參數見表1。取樣和測試項目見表2。

2 結果與分析

2.1 柱效測試結果

循環1～50次使用XK16/40型號層析柱，裝柱高度237 mm，柱體積47.6 mL;循環51～100次使用Tricorn 10/20型號層析柱，裝柱高度210 mm，柱體積16.5 mL，裝柱高度符合商業生產時的要求（160～240 mm）。對使用前和20、40、50、70、90次循環后進行柱效測試，測試結果為對稱因子、理論塔板數均在可接受的標準范圍內（表3），說明經過近90次循環后，層板介質性能沒有明顯變化趨勢。

2.2 動態載量測試結果

從Nuvia S層析介質循環1、50、51、100次后的檢測數據（表4）可以看出，活性（生物學活性、結合活性）、SEC-HPLC純度（聚體、單體）、毛細管電泳純度、DNA去除率、HCP去除率、ProteinA去除率均無明顯下降趨勢，且1、50、51、100次循環后動態載量測試結果均滿足Nuvia S層析使用壽命確認方案的可接受標準。

2.3 不同上樣量測試結果

根據Nuvia S層析介質使用壽命確認方案中的要求，測試不同的上樣量（20、40、80 g/L）對陽離子交換層析工藝、質量的影響，從表5可以看出，SEC-HPLC 純度（聚體、單體）、得率均滿足工藝和質量要求。

2.4 不同流速測試結果

根據Nuvia S層析介質使用壽命確認方案中的要求，測試不同流速（110、149、170 cm/h）對陽離子交換層析工藝、質量的影響，從表6可以看出，SEC-HPLC純度（聚體、單體）、得率均滿足工藝和質量要求。

3 討論與結論

在生物制藥領域，層析純化是關鍵步驟，層析介質循環使用次數直接影響分離提純效果[12]。根據不同產品特性和物料性質，介質壽命均不相同。離子交換層析技術是蛋白類樣品純化處理經常使用的層析技術[13]。對40種基因重組蛋白質和94 種非重組蛋白質生產過程調查統計結果表明，在共有426次層析工序中離子交換層析比例占有40%[14]。單克隆抗體制劑的原液在生產過程中離子交換層析，一般用在親和層析之后，用于去除親和層析沒有除去的聚體、DNA殘留、病毒顆粒以及親和層析介質中脫落的蛋白A配基。陽離子交換層析還可替代親和層析用在單克隆抗體制劑原液在生產過程中的純化捕集。現在大約有6%的單克隆抗體制劑采用了陽離子交換層析捕集純化抗體[15]。與親和層析相比，陽離子交換層析不但有較高的蛋白結合容量，解決單克隆抗體純化過程中要分多次上樣問題，而且陽離子交換層析介質成本遠低于親和層析介質。本研究以Nuvia S層析介質為例，通過小規模的試驗，來檢測介質壽命。陽離子交換層析的原理是通過電荷差異進行陽離子捕獲，核酸和內毒素帶負電，大部分不結合陽離子交換層析，相反，不少單抗屬于堿性蛋白質，可在合適的pH值下結合陽離子交換層析，讓核酸和內毒素穿透。針對其純化原理，研究介質壽命驗證方法，為研究不同用途的層析介質壽命提供思路與數據支持。介質壽命驗證是藥品研發，尤其是生物制品的重點關注內容。企業在做介質壽命驗證時，建議采用等比例縮小純化規模確定每步純化所用介質的使用次數，確保層析介質壽命在使用期限內使用，介質符合生產需求，防止交叉污染，保障產品的質量。層析介質在每次使用時，未被洗脫和流穿的物質或雜質會吸附在填料上，需要采用特定的清洗和再生程序對層析介質進行清洗、再生、保存，以恢復介質最初狀態。長期使用的介質，會逐漸失去效力，如清洗后污染物殘留量、介質使用參數變化、產品重要指標（ 純度） 和收率均不在控制范圍之內，則說明介質的壽命已到期。本試驗中按設計的驗證方案層析介質循環到100次，按驗證方案對相關的工藝參數、質量指標進行測試，與產品實際商業生產的工藝參數、質量指標作對比，如不在工藝參數、質量指標要求范圍內，則說明介質應該更換了，只有對層析介質進行及時更換，才能確保生物制品質量。本研究結果顯示，Nuvia S陽離子層析介質經過100次循環后動態載量測試結果高于起始動態載量的80%，柱效沒有下降趨勢，陽離子交換層析洗脫峰的ProteinA、HCP、DNA殘留檢測未有增高趨勢，SEC-HPLC純度（聚體、單體）、活性（生物學活性、結合活性）以及得率未有下降趨勢;分別以不同上樣量20 g/L（循環8、48、88次）、40 g/L（循環9、49、89次）、80 g/L（循環61、62、63次），不同流速110 cm/h（循環10、50、92次）、149 cm/h（循環61、62、63次）、170 cm/h（循環11、59、93次）進行驗證，陽離子交換層析洗脫峰檢測結果顯示SEC-HPLC純度（聚體、單體）無明顯變化趨勢，均大于98%，得率均大于85%。這些試驗數據均符合CMAB008原液純化工藝及質量標準要求。試驗證明，Nuvia S陽離子層析介質經過100次循環后還可以保持純化效果，因此暫定該Nuvia S陽離子層析介質使用壽命為100次循環，在商業生產過程中，對這次試驗中確定的使用次數進行監測和確認。

參考文獻：

[1]王 旻. 生物工程 [M]. 3版. 北京：中國醫藥科技出版社，2015：1.

[2]藥品注冊管理辦法（2020年修訂）[S]. 北京：國家食品藥品監督管理局，2020.

[3]牛 猛，徐環昕，寧方紅，等. 固定化金屬親和層析分離純化妥布霉素[J]. 離子交換與吸附，2018，34（1）：74-85.

[4]Singh N，Arunkumar A，Peck M，et al. Development of adsorptive hybrid filters to enable two-step purification of biologics [J]. mAbs，2017，9（2）：350-364.

[5]Chiang M J，Pagkaliwangan M，Lute S，et al. Validation and optimization of viral clearance in a downstream continuous chromatography setting[J]. Biotechnol Bioeng，2019，116（9）：2292-2302.

[6]Angelo J，Chollangi S，Müller-Spth T，et al. Virus clearance validation across continuous capture chromatography [J]. Biotechnol Bioeng，2019，116（9）：2275-2284.

[7]David L，Bayer M P ，Lobedann M，et al. Simulation of continuous low pH viral inactivation inside a coiled flow inverter [J]. Biotechnol Bioeng，2020，117（4）：1048-1062.

[8]王軍志. 生物技術藥物研究開發和質量控制 [M]. 2版. 北京：科學出版社，2007：237-258.

[9]Roush D J. Integrated viral clearance strategies-reflecting on the present，projecting to the future [J]. Curr Opin Biotechnol，2018，53：137-143.

[10]藥品生產質量管理規范（2010 年修訂）附錄生物制品[S]. 北京：國家食品藥品監督管理局，2020.

[11]楊紅艷，隋禮麗. 層析介質使用壽命縮小模型的建立和確認 [J]. 中國生物制品學雜志，2013，26（6）：894-896.

[12]王 聰，張 軍，杜 研，等. 親和層析的介質壽命和清洗檢測研究 [J]. 產業與科技論壇，2021，20（24）：48-49.

[13]史清洪，孫 彥. 適應高滴度抗體制備的抗體捕集純化技術研究進展[J]. 化工進展，2019，38（1）：576-585.

[14]Karlsson E，Hirsh I. Ion exchange chromatography [M]//Protein purification：principles，high resolution methods，andapplications. New Jersey：John Wiley & Sons，2011：93-133.

[15]Miesegaes G R，Lute S，Strauss D M，et al. Monoclonal antibody capture and viral clearance by cation exchange chromatography[J]. Biotechnology and Bioengineering，2012，109（8）：2048-2058.