木薯2C型蛋白磷酸酶基因MePP2C55的克隆及表達分析

曾堅 謝雅倩 陳麗萍 顏彥 胡偉

摘要：2C型蛋白磷酸酶（protein phosphatase 2C，PP2C） 基因是ABA信號途徑中主要組成部分，為分析其在木薯非生物脅迫和塊根采后生理性變質 （post-harvest physiological deterioration，PPD）中的作用，采用RT-PCR技術從木薯葉片（SC124）中克隆得到MePP2C55基因。對MePP2C55基因的理化性質、保守結構域、遺傳進化關系、蛋白質結構預測及基因的啟動子元件進行了預測和分析，并對MePP2C55基因在不同處理和PPD過程中的表達進行了分析。結果顯示：（1）MePP2C55基因全長1 100 bp，編碼369個氨基酸殘基，蛋白相對分子量40.7 ku，理論等電點為7.57，含有PP2C的家族結構域。蛋白質序列分析顯示，MePP2C55與橡膠樹和麻風樹的PP2C最相似，分別為88.80%和80.60%。MePP2C55和其他PP2C一樣，在C-端保守。這些結果均表明，MePP2C55基因屬于PP2C家族。（2）MePP2C55基因在不同木薯組織中的表達均較高，在側芽和葉柄中最高。（3）MePP2C55基因屬于ABA核心通路，所以啟動子序列分析顯示含有10個ABRE （abscisic acid responsiveness） 元件。MePP2C55基因能被PEG和ABA處理顯著誘導，且在PPD過程中也能被顯著誘導。從上述結果可推測，MePP2C55基因具有提高植物應對非生物脅迫的潛力，同時也參與了PPD過程，為下一步研究該基因在木薯采后和抗逆中的功能提供了線索。

關鍵詞：ABA;MePP2C;非生物脅迫;采后生理性變質;表達分析

中圖分類號： S533? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）08-0073-06

脫落酸 （abscisic acid，ABA） 是一種非常重要的植物激素，它能夠調控植物的生長發育，也是植物應對不同逆境的重要信號因子[1]。ABA信號可以提高植物在高滲、干旱和高鹽等逆境中的生存能力。2C類蛋白磷酸酶 （protein phosphatase 2C，PP2C） 是ABA信號通路中重要的組成成分之一。在ABA信號轉導過程中，PYR/PYL/RCAR為ABA受體，通過接收上游的信號進行信息傳遞;SnRK2屬于信號通路正調控因子;PP2C屬于信號通路負調控因子。從而ABA受體、SnRK2和PP2C共同組成了ABA介導的信號通路[2-4]。PP2C屬于蛋白磷酸酶中的PPM類，是一類活性依賴于Mg2+或Mn2+等離子且進化保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶[5]。

PP2C是高等植物體內廣泛存在的蛋白磷酸酶，在植物中也是一個數量龐大的蛋白家族。它沒有調節亞基，是一種單體酶。PP2C蛋白的C-端是保守的催化區域，N-端保守性很弱，能夠結合不同的序列，所以PP2C 的功能比較多樣化。在植物中，目前總共發現了6 種PP2C磷酸酶，如ABI1、ABI2、ABI3、HAB2、AHG1 和PP2CA/AHG3[6]。到目前為止，水稻中找到90個PP2C基因[7]，擬南芥中找到80個，二穗短柄草中找到86個[8]。PP2C 在植物中參與了不同信號途徑的轉導，在ABA信號轉導途徑中[9]，ABA受體蛋白、SnRK2與PP2C三者結合共同調控相關轉錄因子、干旱/低溫脅迫和植物創傷/種子休眠/萌發等信號轉導途徑[6]。在小麥中過表達Wcs120（PP2C基因）提高了植株的耐冷性[10]。在擬南芥中，A亞族的PP2C蛋白對ABA 信號轉導均具有負調控功能[11-13]。玉米中ZmPP2C基因是干旱和鹽脅迫反應中的負調控因子[14]。在水稻中，A亞族的PP2C蛋白成員能夠不同程度地響應ABA、低溫、高鹽等逆境脅迫[15]。

木薯（Manihot esculenta Crantz） 是熱帶及亞熱帶地區廣泛種植的作物，約有8億人將木薯作為主糧[16]。木薯主要在我國華南地區種植，種植面積約50萬hm2，總產量不低于 100億kg/年，總產值不低于140億元/年，是華南地區一種重要的經濟作物[17]。木薯的淀粉含量高，具有很好的抗旱和耐貧瘠特性，可作為重要的綠色能源作物[17-19]。但木薯采收后的塊根容易出現“采后生理性變質（post-harvest physiological deterioration，PPD）”，因而存儲期短，大大限制了木薯塊根的大規模利用[20-22]。目前，關于木薯中PP2C基因家族的研究還很少[23]。因此，對木薯PP2C相關基因進行克隆和相關的表達分析，有利于分析PP2C基因在木薯抗逆過程和PPD過程中的表達調控，為研究其功能有重要意義。本試驗通過克隆MePP2C55基因，對其編碼蛋白序列進行生物信息學分析，同時對MePP2C55在干旱脅迫、ABA處理和PPD過程中的表達模式進行了分析，為研究MePP2C55基因功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

木薯材料為中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所保存的木薯品種SC124 （Manihot esculenta cv. SC124）。樣品取自中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所溫室大棚，2020年4—10月在中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所完成試驗。RNA提取試劑和反轉錄試劑分別購自天根生化科技（北京）有限公司和Fermentas公司。生工生物工程（上海）股份有限公司合成PCR引物。

1.2 材料處理

木薯種莖切成合適長度 （15 cm左右） 的莖稈小節，每個小節有3～4個芽點，分別種入盆中生長，盆中的土壤為蛭石 ∶營養土=1 ∶1（體積比）。取生長約60 d后生長狀況一致的幼苗進行后續的試驗處理。使用200 mg/mL PEG-6000模擬干旱，對照植株澆水，分別在0、3、5、7 d后收集相應處理時間植株的葉片（取植株的老葉、第1張完全展開葉和未展開葉混合為1個樣品，共5個），葉片樣品在液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中;ABA處理濃度為100 μmol/L，分別在0、3、5、7 d收集處理后植株的葉片，葉片樣品液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中;木薯塊根的生長期約為10個月，置于培養箱內進行暗培養 （25 ℃、70%相對濕度），在 0、6、12、48 h收集相應處理時間后的塊根，塊根液氮速凍后置于 -80 ℃ 冰箱內保存（樣品取3個重復）。

1.3 基因克隆

葉片cDNA模板通過反轉錄葉片RNA獲得。根據Phytozome數據庫中的木薯同源序列 （Manes.06G158800） 設計引物（P1，5′-ATGAATCAACTCACCGTCATCA-3′;P2，5′-TTAAGAAATGCTGCCAAGTTTA-3′），以葉片cDNA為基因克隆模板進行MePP2C55克隆，擴增產物由生工生物工程（上海）股份有限公司測序進行驗證。

1.4 生物信息學分析

BLASTp搜索NCBI中和MePYL12同源的蛋白質序列;理化性質使用ExPASy ProtParam進行計算和預測;蛋白的結構預測使用SWISS-MODEL和SOPMA等在線網站[23];在線網站Plantcare進行基因的啟動子元件分析 （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）;保守結構域使用NCBI-CDD在線數據庫預測;序列比對采用DNAMAN6;進化樹采用NJ法構建;引物設計使用軟件Primer 5.0。

1.5 基因的表達分析

上海美吉生物醫藥科技有限公司完成處理樣品的RNA提取和建庫，然后通過Illumina GAⅡ （美國Illumina公司） 測序平臺進行測序，測序數據處理方法見參考文獻[24]。本研究的基因表達水平為FPKM （fragments per kilobase per million mapped reads） 值。

2 結果與分析

2.1 MePP2C55基因的克隆

采用序列比對的方法，在Phytozome數據庫中搜索得到1個木薯序列Manes.06G158800，屬于PP2C家族。以Manes.06G158800序列進行引物設計并擴增，測序得到1個全長為1 110 bp的片段 （圖1），氨基酸總數為369個，將其命名為MePP2C55基因。MePP2C55蛋白預測的分子式為C1 752H2 891N527O552S17，理論等電點為7.57，蛋白相對分子量40.7 ku，不穩定系數為47.0，預測為不穩定蛋白。MePP2C55蛋白的二級預測顯示，α-螺旋占38.59%，β-轉角占7.07%，延伸鏈占20.65%，無規則卷曲占33.70%。MePP2C55蛋白的三級結構預測顯示與其二級結構預測結果一致（圖2）。保守結構的預測分析（圖3）顯示，MePP2C55蛋白含有PP2C的家族結構域，這些預測結果表明克隆得到的基因屬于PP2C家族基因。

2.2 MePP2C55氨基酸序列同源性比對和系統發育分析

以MePP2C55基因的氨基酸序列為探針，在相應數據庫 （NCBI） 中進行序列比對，將其中同源性較高的蛋白序列下載下來，其中橡膠樹（XP_021656134.1）的序列一致性最高，達到88.80%，其次是達到80.60%的麻風樹（XP_012090097.1）。在多重序列比對中發現，PP2C基因的氨基酸序列和其他報道相一致，在C-端保守。保守結構域分析也顯示，PP2C蛋白氨基酸序列在進化上高度保守、高度相似，和橡膠樹及麻風樹的保守元件完全相同（圖4）。MePP2C55和HbPP2C、RcPP2C都屬于大戟科，這些結果表明，MePP2C55基因屬于PP2C家族。

2.3 MePP2C55基因的組織表達分析

以數據庫 （shiny.danforthcenter.org/cassava_atlas/）中的木薯組織表達數據來分析MePP2C55基因的組織表達差異。結果顯示，MePP2C55基因在不同組織中的表達都較高，在側芽和葉柄中的表達最高 （圖5）。

2.4 MePP2C55基因在不同處理條件下的表達分析

MePP2C55基因屬于ABA信號通路的核心組分，所以啟動子序列分析顯示含有10個ABRE （abscisic acid responsiveness） 元件。MePP2C55基因都能被PEG和ABA處理顯著誘導。MePP2C55基因的相對表達量在ABA處理3 d后達到最高，為不處理時的2.6倍，隨后慢慢下降到1.8倍;而在PEG處理中，MePP2C55基因的相對表達量隨著處理時間延長而不斷增加，在7 d時達到最高，為不處理時的3.5倍 （圖6）。

MePP2C55基因的相對表達量也和木薯塊根的采后生理性變質過程密切相關。MePP2C55基因的相對表達量隨著采后時間增加不斷提高，在采后 48 h 達到最大值，總共提高了12.2倍，表明MePP2C55基因的表達在該過程中明顯受到誘導 （圖7）。

3 討論與結論

PP2C基因家族的數量在不同的植物物種中并不相同，而PP2C屬于ABA信號途徑的核心組成，因此研究PP2C的功能有助于闡述ABA信號通路。本研究克隆得到木薯MePP2C55基因， 氨基酸殘基總數為369個，具有PP2C的家族結構域（圖4），序列比對分析顯示，包含和其他PP2C基因類似的保守C末端催化結構域，它屬于A類PP2C[25]。在親緣關系上MePP2C55與橡膠樹HbPP2C和及麻風樹JcPP2C較近。這些結果都證明MePP2C55基因屬于PP2C家族基因。

木薯是一種在熱帶被廣泛種植的糧食和經濟作物，具有粗生易長等特點[26]。在木薯的生產實踐中由于木薯塊根在收獲后極易出現PPD現象，從而導致其在工業生產中受到大大的限制[20-22]。在果實的成熟和采后存儲過程中，ABA信號具有非常重要的作用，有研究表明ABA信號的傳遞對果實最終的存儲品質和相應的采后相關生理指標具有顯著影響[27]。ABA信號途徑也是植物響應非生物逆境的重要信號通路，PP2C是核心的組成成分[28]。模式植物擬南芥中鑒定得到的A類PP2C基因都能對ABA信號進行負調控，其中多個基因和氧化脅迫相關，此外AHG3還參與抗冷脅迫[11-13]。在小麥中分離得到的PP2C基因Wcs120也能夠提高小麥的抗寒能力[10]。苜蓿中的PP2C受到逆境脅迫的誘導[29]。冰葉日中花克隆得到的10個PP2C 類基因都響應非生物逆境的脅迫[30]。玉米PP2C 基因在高鹽和干旱脅迫中屬于負調控因子[14]，而山毛櫸（Fagus longipetiolata Seem.）中的PP2C2則屬于正調控因子[31]。A類PP2C基因在重要作物水稻中都可以在對非生物逆境如高鹽、干旱和低溫等逆境有不同的響應程度[15]。木薯經過干旱和ABA處理后，MePP2C55基因的表達明顯受到誘導，在擬南芥中A類PP2C家族基因通常屬于非生物逆境脅迫和ABA信號途徑的負調控因子，但FsPP2C2基因的超表達能夠提高植株耐受逆境脅迫的能力和對ABA信號的敏感性[31]，同時AtPP2CG1基因的超表達也能夠提高植株對高鹽的耐受及對ABA信號的敏感性[32]。因此，MePP2C55基因可能是木薯響應非生物脅迫和ABA信號的正調控因子。在PPD過程中MePP2C55基因的表達也顯著受到誘導。例如，在擬南芥中超表達PdPP2C基因能夠提高植株的對氧化脅迫的能力[33]。在煙草中超表達ZmPP2C2基因能夠提高植株中抗氧化酶的活性[34]。OsBiPP2C1也和細胞中的抗氧化酶活性密切相關[35]。由此推測，MePP2C55基因參與了木薯PPD的抗氧化過程。以上結果為下一步研究MePP2C55基因在延緩木薯PPD過程和提高非生物脅迫中的適應能力提供了參考。

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