西馬特羅單克隆抗體的制備及膠體金快速檢測卡的研發

劉穎沙 劉昭彤 曹亞岐 魯瑤 岳彩洋 任若春

摘要：在國家糧食安全戰略下，瘦肉精對人們健康造成很大威脅和沖擊，目前市面上三聯卡較多，對于鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇3種類型的瘦肉精研究較多。通過制備西馬特羅單克隆抗體，優化膠體金標記及C、T線包被條件，制備能夠快速檢測豬肉中的西馬特羅殘留量的膠體金快速檢測卡。結果表明，單克隆抗體的免疫球蛋白亞類為IgG1，分子量為148.5 ku，染色體數目為83～91 條，親和常數為2.51×108 mol/L，最適pH值為7.5，最佳抗體標記量為6 μL/mL，最佳離心條件為8 000 r/min，T線最適包被濃度為1.0 mg/mL，C線包被濃度為0.5 mg/mL，對西馬特羅的檢測限（靈敏度）為10 ng/mL，與鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、妥布特羅無交叉反應，特異性好。與酶聯免疫吸附法的20份樣品符合率良好，提示新研發的檢測卡檢測結果準確、靈敏度高，可在屠宰、養殖環節中完成豬肉西馬特羅的現場檢測。

關鍵詞：西馬特羅;單克隆抗體;瘦肉精;豬肉;快速檢測卡

中圖分類號：TS251.7 ??文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）08-0182-05

瘦肉精，可提高動物瘦肉率，抑制肥肉生長[1-3]。對于瘦肉精的快速檢測，科研工作研發快速檢測卡、試劑盒等[4]，柳海燕等研制成功可用于現場檢測二聯速測紙條，可測定2項瘦肉精[5]。任清丹等對三聯速測卡準確度優化提出改進措施，提供技術攻關[6]。喻俊磊等對動物源性食品中3項瘦肉精檢測卡進行穩健性評價，采用評價測試法[7]。對于鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇3種類型的瘦肉精研究較多[8-11]。

西馬特羅，能促進腺苷酸環化酶的合成，從而降低脂肪合成率，增加肌肉中的蛋白質[12]。其與鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺等10余種物質類似，俗稱均為瘦肉精[13-14]。

在國家糧食安全的戰略下，瘦肉精對人們的健康造成了很大的威脅和沖擊，人們對于食品安全的意識逐步加強，科研工作者研發相關的檢測方法。對于西馬特羅，目前主要采用高效液相色譜法、氣質聯用法、液質聯用法及新興的酶聯免疫法進行檢測，但是對于更加快速的膠體金免疫層析法文獻較少，因此本研究通過制備西馬特羅單克隆抗體，優化膠體金標記以及CT線包被條件，制備能夠快速檢測豬肉中西馬特羅殘留量的膠體金快速檢測卡。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2020—2021年在陜西楊凌進行研制西馬特羅，豬肉組織樣品、尿樣，采自楊凌家香牧業有限公司。

西馬標準品（≥98.0%）、鹽酸克倫特羅-瘦肉精（98.8%）、沙丁胺醇標準品、妥布特羅標準品（99.8%），購自于壇墨質檢標準物質中心;氯化金、檸檬酸三鈉、抗壞血酸、鞣酸、Tween-20購自于西安企鵝生物科技有限公司;牛血清白蛋白（BSA）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）購自于Sigma;Tris-HCl、羊抗兔 IgG、吸水紙、硝酸纖維素膜（NC膜）、結合墊、樣品墊購自于上海捷寧生物科技有限公司;其他試劑均為國產分析純購自于楊凌三力化玻站。

1.2 儀器與設備

磁力攪拌器，購自于上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司;劃膜噴金儀購自于上海捷寧生物科技有限公司;可編程切條機，購自于上海捷寧生物科技有限公司;酶標儀，購自于美國伯樂公司;分析天平（萬分之一），購自于梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司;分光光度計購，自于上海天普分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 西馬特羅單克隆抗體制備

1.3.1.1 人工抗原的合成

西馬特羅含有芳伯氨基，在強酸和冷卻條件下芳伯氨基可以生成親電的重氮鹽，與蛋白中的給電子基團如酪氨酸、組氨酸殘基反應，生成偶氮產物，制備成具有良好免疫原性。本研究采用西馬特羅作為半抗原與載體蛋白（HSA、BSA、OVA等）偶聯制備人工抗原[12]。

將西馬特羅、載體蛋白及兩者結合物配制成一定濃度的溶液，然后采用紫外分光光度計進行全波長掃描，經過計算分析得到人工抗原的結合比和濃度。

CIM-BSA、CIM-HSA、CIM-OVA結合比分別為10 ∶1、15 ∶1、7 ∶1，濃度分別5.5、6.8、3.2 mg/mL。

1.3.1.2 抗體的制備 （1）動物免疫。以CIM-BSA作為免疫原，免疫雌性BALB/c小鼠。免疫時間一般需要間隔2周[15]。（2）單克隆抗體的制備。3免后第7天，采血清測效價，并分離陽性血清作對照[16]。

無菌操作取小鼠的脾細胞與SP2/0細胞融合（比例數10 ∶1）。待細胞長至孔底的1/2～1/3時，采用已建立的ELISA方法篩選，最終得到3株穩定分泌單克隆抗體的細胞[17]，編號為1A-4H-5G、3B-5G-3H、6B-3D-3H。

1.3.2 標記條件優化

1.3.2.1 pH值條件優化

取6個1.5 mL的離心管，取1.0 mL膠體金溶液加入到離心管中，使每個離心管的pH值依次為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，搖勻，分別加入5 μL克倫特羅單克隆抗體，5～10 min 后再加入20%BSA溶液20 μL，放置5～10 min 后進行離心（8 000 r/min，10 min），棄上清，加入200 μL復溶液重懸，通過試紙條上T線的顯色程度確定最佳pH值。

1.3.2.2 抗體標記量條件優化

取7個1.5 mL 離心管，取1.0 mL膠體金溶液加入到離心管中，將pH值調節至7.5，分別在每個離心管中加入1、3、5、10、20、40 μL西馬特羅單克隆抗體，5～10 min后再加入20% BSA溶液20 μL，放置5～10 min后進行離心（8 000 r/min，10 min），棄上清，加入200 μL復溶液重懸。最佳標記量為最小標記量的1.2倍，最小標記量是抗體加入量最小的情況下檢測線抑制效果佳。

1.3.2.3 離心力優化

取7個1.5 mL的離心管，取1.0 mL膠體金溶液加入到離心管中，將pH值調節至7.5，分別在每個離心管中加入12 μL西馬特羅單克隆抗體，搖勻后，靜止5～10 min，再加入20% BSA溶液20 μL，分別于3 000、5 000、8 000、12 000 r/min 離心8 min，離心完后看上清液是否澄清及探針是否容易重懸。

1.3.3 免疫層析墊點樣濃度的確定

1.3.3.1 T線點樣濃度的確定

將包被西馬特羅抗原稀釋成0.5、0.8、1.0 mg/mL，包被至NC膜上，根據T線陰性顯色選擇及檢測限選擇最適T線包被濃度。

1.3.3.2 C線點樣濃度的確定

將二抗濃度稀釋成0.5、1.0、1.5 mg/mL，包被至NC膜上，根據C線與T線陰性顯色選擇最適C線包被濃度。

1.3.4 膠體金快速檢測西馬特羅方法建立

1.3.4.1 標記膠體金

調整10 mL膠體金的pH值（稍高于最佳）和抗體濃度（最佳），低溫攪拌充分反應0.5 h，添加10%的20 μL/mL BSA封閉 15 min，分裝成10個1.5 mL小離心管，在最佳轉速和時間條件下離心，使金標蛋白沉淀于底部，舍去上清液，將金標蛋白沉淀用膠體金復溶液溶解，調整鋪金濃度，得到金標抗體溶液。在玻璃纖維素膜上進行噴涂，冷凍干燥后制作成為金標墊。

1.3.4.2 NC膜T線和C線的包被

西馬特羅抗原稀釋調整濃度為最佳顯色濃度，并包被于NC膜的T線位置，即檢測線（T線）;羊抗鼠IgG抗體稀釋調整濃度為最佳顯色濃度，并包被于NC膜的C線位置，即質控線（C線），形成免疫NC膜。再進行干燥處理，其中干燥溫度為37 ℃，干燥時間為30～50 min，接著在封閉液中封閉，最后干燥即可。

1.3.4.3 樣品墊

樣品墊的前處理是需要玻璃纖維素膜浸沒入封閉液進行封閉，再干燥即可。

1.3.4.4 吸水墊

吸水墊一般為普通的濾紙材料。

1.3.5 速測卡的組裝

在底板上從左到右依次為樣品墊、金標墊、NC膜以及吸水墊，最下層為NC膜，NC膜左側1.0 mm上壓金標墊，在NC膜右側1.0 mm處上壓吸水墊，在金標墊1.0 mm處上壓樣品墊，裁剪成3.5 mm寬的試紙條，裝于塑料卡殼內，完成速測卡的組裝。加樣只需要吸取樣品3滴（100 μL）加入樣品孔中即可。

1.3.6 速測卡的性能檢測

將100 μL待檢樣品逐滴加入速測卡的樣品孔內，待10 min觀察T線和C線的顯色狀態，記錄現象和顯色所需時間。

1.3.6.1 特異性試驗

取西馬特羅相似物鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇和妥布特羅，分別用甲醇溶解，再用PBS緩沖液稀釋成濃度為5、10、15、20、40、100 ng/mL 的溶液，采用空白溶液作為陰性對照，觀察不同類似物在試紙條上的顯色情況，采用速測卡進行檢測，觀察現象并記錄數據。

1.3.6.2 靈敏性試驗

取西馬特羅標準品，先用甲醇溶解，配制成濃度為10 μg/mL的溶液;然后用PBS緩沖液將標準品稀釋成不同濃度（5、10、15、20、40、100 ng/mL）的溶液，同時制備陰性對照。本測試卡為競爭抑制原理設計而成，隨著濃度變大，T線顯色變淺，C線變深。因此，視覺極限檢測限（LOD）即為T線不顯色而C線顯色明顯的濃度值。

1.3.6.3 準確度試驗

采用膠體金法和ELISA法進行實際豬肉20份樣品檢測，將檢測結果進行時間和效果比對，確定可行性和檢測效果的精準性。

2 結果與分析

2.1 西馬特羅單抗的制備以及效價檢測結果分析

2.1.1 單克隆抗體的鑒定

經間接ELISA檢測、染色體計數、SDS-PAGE電泳和ELISA單克隆抗體亞型檢測試劑盒檢測，表明單克隆抗體的免疫球蛋白亞類為IgG1，分子量為148.5 ku，染色體數目為83～91條，親和常數為2.51×108 L/mol。

2.1.2 抗體的交叉反應率

選擇與西馬特羅類似結構或功能的物質替代西馬特羅標準溶液，繪制標準曲線計算IC50抑制濃度。結果發現，單克隆抗體對西馬特羅的交叉反應為100%，對沙丁胺醇的交叉反應率為8%，對妥布特羅的交叉反應率為15%，對克侖特羅的交叉反應率為10%，對氯丙那林和特布他林的交叉反應分別為5%與4%，對萊克多巴胺、非諾特羅、噴布特羅、克侖巴胺、氧烯洛爾、異丙腎上腺素、腎上腺素和去甲腎上腺素的交叉反應均<0.1%。

選擇與克倫特羅類似結構或功能的藥物替代克倫特羅標準溶液，繪制其標準曲線，并計算IC50抑制濃度，計算交叉反應率，結果見表1。

2.2 標記條件優化結果

2.2.1 pH值條件優化結果

由圖1可知，根據膠體金標記的原理，在pH值接近和稍高于蛋白的等電點時，膠體金蛋白吸附力最強;pH值過高或過低均不利于兩者結合，當pH值為7.5時，T線顯色最深，所以最適pH值為7.5。

2.2.2 抗體標記量條件優化結果 由表2可知，膠體金標記的2個關鍵環節是標記時pH值和最佳蛋白質標記量的確定。當抗體標記量在5 μL/mL時，陰性T線顯色及檢測限顯色梯度最大;當抗體標記量為10 μL/mL時，陰性雖然顯色更深，但是檢測限抑制也會變差;當抗體標記量大于10 μL/mL時，陰性顯色會變淺，并且檢測限抑制也比較差，所以最佳抗體標記量為5 μL/mL的120%，即為6 μL/mL。

2.2.3 離心條件優化結果

當轉速為3 000、5 000 r/min 時，上清液渾濁，說明轉速不夠，還有一部分膠體金沒有離心下來。當轉速為8 000、12 000 r/min 時，上清液澄清，但轉速為 12 000 r/min 時探針不容易重懸，說明最佳轉速為 8 000 r/min。

2.3 NC膜包被條件優化結果

2.3.1 T線

由T線包被濃度顯色結果（表3）可知，隨著包被抗原濃度的增加，T線顯色變強，當抗原包被濃度為1.0 mg/mL時，T線陰性顯色及檢測限顯色差異最大，所以T線最適包被濃度為 1.0 mg/mL。

2.3.2 C線

由C線包被濃度顯色結果（表4）可知，隨著二抗包被濃度的增加，C線顯色變強，當二抗包被濃度為0.5 mg/mL時，C/T線顯色基本一致，所以C線最適包被濃度為0.5 mg/mL。

2.4 卡片應用性檢測

2.4.1 靈敏度檢測

由圖2和表5可知，西馬特羅檢測卡在5 ng/mL標準品時，T線顯色略微有影，10 ng/mL 標準品時，T線不顯色，說明西馬特羅檢測卡的靈敏度為10 ng/mL。

2.4.2 特異性檢測

由圖3和表6可知，添加不同濃度的鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、妥布特羅標準品，對西馬特羅檢測卡均未發生抑制作用，說明西馬特羅檢測卡與鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、妥布特羅無交叉反應，特異性好。

2.4.3 準確度檢測

由準確度檢測結果（表7）可知， 研制的西馬特羅檢測卡與酶聯免疫吸附法的20份樣品符合率良好。

3 結論

在國家糧食安全的戰略下，瘦肉精對人們健康造成了很大的威脅和沖擊，市面上對于西馬特羅的快速檢測方法研究較少。本研究通過制備西馬特羅單克隆抗體，探索發現最適pH值為7.5，最佳抗體標記量為6 μL/mL，最佳離心條件為8 000 r/min，得出T線最適包被濃度為1.0 mg/mL，C線包被濃度為0.5 mg/mL，制備能夠快速檢測豬肉中西馬特羅殘留量的膠體金快速檢測卡，卡片靈敏度為 10 ng/mL，與鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、妥布特羅無交叉反應，特異性好。與酶聯免疫吸附法的20份樣品符合率良好，說明新研發的檢測卡檢測結果準確、靈敏度高，具有應用價值，可在屠宰、養殖環節中完成豬肉西馬特羅的現場檢測。

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