冬青衛矛LTR反轉錄轉座子RT序列克隆及分析

賀詩琪，范付華，吳宇航，龍 蓉，王君榮，陳美吉

(1.貴州大學 貴州省森林資源與環境研究中心/貴州省高原山地林木培育重點實驗室,貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 林學院,貴州 貴陽 550025)

反轉錄轉座子是一種可移動的遺傳元件，可以引起物種特異性狀變異，在植物基因組中廣泛存在，反轉錄轉座子的激活對植物基因組的不斷進化有顯著影響，是物種遺傳多樣性的一個重要因素。與DNA“剪切—粘貼”式的轉座機制不同，反轉錄轉座子以自身轉錄而成的RNA為中間體，通過編碼的反轉錄酶反轉錄成DNA后插入基因組新位點，原位置成分并不會被切除，因此能夠在基因組中不斷的自我復制增加拷貝數從而影響基因的活性以及基因組的結構。反轉錄轉座子在植物發育過程中通常是轉錄沉默的，在外界環境因素和內在生物因子的刺激下能夠激發其轉座功能，引起基因組結構變化甚至相應基因功能的變異。

反轉錄轉座子分為LTR(long terminal repeats)反轉錄轉座子和非LTR反轉錄轉座子兩大類。其中，LTR反轉錄轉座子兩類成員Ty1-與Ty3-在水稻、梨、桂花、蘋果、梨、枇杷等植物中均有報道。冬青衛矛()種質資源豐富、隨處可見，不僅具有經濟、生態和觀賞效益，更具有一定藥用價值。目前，鮮見有關冬青衛矛LTR反轉錄轉座子研究的報道。植物LTR反轉錄轉座子可以采用同源序列克隆法獲得大量Ty1-類與Ty3-類反轉錄轉座子反轉錄酶(reverse transcriptase，RT)序列，因其多拷貝、高多態性等特點具有非常高的研究價值，為植物遺傳進化提供了素材；RT序列的測定，不僅可以對植物轉座子的多態性進行監測分析，還可以此設計分子標記對植物種質資源親緣關系等進行分析。

本文利用LTR反轉錄轉座子RT序列保守區簡并引物克隆并分析冬青衛矛RT序列特點，揭示LTR反轉錄轉座子RT序列在冬青衛矛基因組中的異質性，為植物反轉錄轉座子在基因組進化關系中的研究提供依據，也為冬青衛矛分子標記的開發種質鑒定、遺傳多樣性評價等提供依據。

1 材料與方法

1.1 DNA的提取與檢測

以采集的貴州冬青衛矛葉片為材料，利用DNA提取試劑盒(DNAsecure Plant Kit(DP320-03)，北京天根生化科技有限公司)提取冬青衛矛基因組DNA，通過瓊脂糖凝膠(1%)電泳和超微量核酸蛋白測定儀(德國Implen，N60 Touch)檢測其質量、濃度，并用緩沖液(TE)稀釋提取的DNA直至濃度約為20 ng/μL，低溫保存備用。

1.2 LTR反轉錄轉座子RT序列的PCR擴增

冬青衛矛RT序列引物參照前人的設計，與本課題組克隆枇杷RT序列的引物和反應條件一致。Ty1-類RT上游引物為5’-ACNGCNTTYYTNCAYGG-3’，下游引物為5’-ARCATRTCRTCNACRTA-3’；Ty3-類RT上游引物為5’-AGMGRTATGTGYGTSGAYTAT-3’，下游引物為5’-CAMCCMRAAMWCACAMTT-3’；其中N表示A/G/C/T堿基，M表示A/C，R表示G/T，Y表示C/T，S表示C/G，W表示A/T堿基。PCR反應體系為10 μL，其中PCR MasterMix(北京天根生化科技有限公司)5 μL，模板DNA和引物各0.5 μL。PCR程序參照課題組羅昌斌等的研究。取3 μL的PCR擴增產物，瓊脂糖凝膠電泳檢測，用凝膠成像系統(美國Bio-Rad，ChemiDoc XRS+)觀察并拍照保存。

1.3 PCR產物的回收、轉化及測序

使用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TIANgel Midi Purification Kit,DP209-02)回收純化PCR產物，且通過超微量核酸蛋白測定儀檢測其質量和濃度。使用TaKaRa pMD19-T Vector Cloning Kit試劑盒和DH5α Competent Cell感受態細胞將PCR產物進行連接和轉化。取已轉化的感受態細胞在37 ℃無菌環境中倒置培養12～16 h，通過PCR擴增篩選陽性克隆，搖菌過夜培養，提取質粒后測序。

1.4 RT序列生物信息學分析

過濾出RT序列測序結果中的質粒基因組序列后，將所獲得的Ty1-與Ty3-類RT序列通過NCBI數據庫查詢、對比，Bioedit翻譯為氨基酸序列且構建序列相似矩陣以除去完全重復序列。采用ClustalX軟件進行氨基酸序列多重比對，MEGA7軟件構建LTR反轉錄轉座子RT序列的系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 冬青衛矛RT序列特征

采用PCR擴增，將特征片段回收、測序，再去除重復和短序列后，獲得冬青衛矛LTR反轉錄轉座子Ty1-類RT(EJT1)序列40條，Ty3-類RT(EJT3)序列39條，此次得到的序列與其他植物RT序列長度大致一樣。序列長度、A/G比例及登錄號見表1。

表1 冬青衛矛Ty1-copia與Ty3-gypsy類反轉錄轉座子RT序列信息Tab.1 The information of RT sequences of LTR retrotransposon in E. japonicus

2.2 Ty1-copia類RT序列分析

本研究得到40條Ty1-類RT序列，長度范圍為231～267 bp，其中AT所占的比例為48.85%～65.27%。核酸序列的相似性為8.05%～97.7%，平均相似性為40.2%，其中序列EJT1-5、EJT1-30與EJT1-2的相似性最高，為97.7%；序列EJT1-4與EJT 1-7的相似性最低，為8.05%。這表明冬青衛矛Ty1-類RT堿基序列差異較大，具有較高的異質性。利用MEGA7軟件的最大似然法將克隆所得到的冬青衛矛Ty1-類反轉錄轉座子RT序列進行系統進化分析，可將40條序列分為5類(圖1)。其中第Ⅰ類有27條序列，第Ⅱ類有6條序列，第Ⅲ類僅有1條序列為EJT1-22，第Ⅳ類包含4條序列，第Ⅴ類有2條序列為EJT1-34和EJT1-45。第Ⅰ類所包含的序列條數最多且分散，而第Ⅲ類序列EJT1-22相較于其他類別中的序列的遺傳距離較大。

注：樹枝長度表示估算得到的遺傳距離，樹的分支處數值表示1000次重復的自展值(下同)。圖1 冬青衛矛Ty1-copia-RT核酸序列進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of RT nucleotide sequences of Ty1-copia retrotransposons in E. japonicus

將所獲得的 RT序列分別翻譯為氨基酸序列，可以發現沒有終止密碼子突變。參照Ty1-類RT氨基酸的保守序列，發現多處移碼突變。例如EJT1-37的50位氨基酸處；EJT1-19的5位氨基酸處；EJT1-3、EJT1-6、EJT1-12、EJT1-14等8條氨基酸序列的19位氨基酸處；EJT1-30、EJT1-31的24位氨基酸處等(圖2)。

圖2 冬青衛矛Ty1-copia-RT氨基酸(aa)序列多重比對分析Fig.2 The amino sequence alignment of RT of Ty1-copia retrotransposons in E. japonicus

從NCBI中下載已登錄的來源于蘋果(ABD76 543，)、棗(JQ003714，)、鐵皮石斛(KJ147111，)、辣椒(JQ026381，)、李(AGX455 20，)、梨(JN639033，)、小麥(BAA02264，)等12條其他植物的Ty1-類反轉錄氨基酸序列，將它們與本文所得的冬青衛矛Ty1-類RT氨基酸序列進行多序列比較，構建相應系統進化樹，可將所有序列分為4類(圖3)。其中第Ⅰ類包含18條冬青衛矛Ty1-類RT序列，占所測序列的近一半，同時還有10條其他植物RT氨基酸序列在內，蘋果、李、辣椒等三條序列比起其他序列與此次目標序列的遺傳距離近，也說明他們的親緣關系較近；第Ⅱ類有3條序列分別為EJT1-37、EJT1-38和EJT1-14，還包含有棗序列JQ003714，三者在進化關系中比較接近，聚為一類；第Ⅲ類僅有1條序列為EJT1-6；第Ⅳ類包含18條序列且沒有其他植物的氨基酸序列聚在一起，這18條序列之間具有較高的相似性，與其他植物的差異明顯。

圖3 其他植物與冬青衛矛Ty1-copia-RT氨基酸(aa)序列進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of RT aa sequences of Ty1-copia between other plants and E. japonicus

2.3 Ty3-gypsy類RT序列分析

從冬青衛矛DNA中克隆得到39條Ty3-類RT序列，長度范圍為365～499 bp，這些序列中AT所占比例為46.29%～63.47%，核酸序列的相似性為10.04%～99.31%。其中序列EJT3-14與EJT3-17、EJT3-20與 EJT3-30的相似性最高，為99.31%，序列EJT3-3與 EJT3-27的相似性最低，為10.04%。將39條Ty3-類反轉錄轉座子反轉錄酶DNA序列構建系統進化樹，總共可以分為5類(圖4)。其中第Ⅰ類有25條序列，第Ⅱ類包含2條序列，第Ⅲ類僅有1條序列為EJT3-38，第IV類含有9條序列，第V類也僅有2條序列為EJT3-11和EJT3-46。

圖4 冬青衛矛Ty3-gypsy-RT核酸序列進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of RT nucleotide sequences of Ty3-gypsy retrotransposons in E. japonicus

將所得39條RT序列翻譯為氨基酸。參照Ty3-類RT氨基酸的保守序列，可以發現所得的冬青衛矛Ty3-類RT氨基酸序列有移碼突變的情況。例如EJT3-24的8位氨基酸處，EJT3-25的49位氨基酸處，EJT3-6、EJT3-32、EJT3-35等6條的90位氨基酸處，EJT3-40的116位氨基酸處等(圖5)。

圖5 冬青衛矛Ty3-gypsy-RT氨基酸(aa)序列多重比對分析Fig.5 The amino sequence alignment of RT of Ty3-gypsy retrotransposons in E. japonicus

通過NCBI下載已登錄的鋸齒列當(ABD43 099，)、梅(ACU42192，)、草莓(EF443064，)、銀杏(AJ228325，)、李(AGX45505，)、馬尾松(AGD93162，)、火龍果(KU977005，)、桂花(KY401399，)等其他植物Ty3-類RT氨基酸序列，與本文獲得相關序列進行多重比對分析，并構建系統進化樹，可將所有序列分為4類(圖6)。其中第Ⅰ類包含10條冬青衛矛Ty3類RT序列，還包含馬尾松AGD93162、鋸齒列當ABD43099、桂花KY401399、銀杏AJ228325和梅ACU42192等RT氨基酸序列在內；第Ⅱ類僅有1條序列為EJT3-32；第Ⅲ類有9條序列，且無其他植物分入此類，這9條序列相似性高；第Ⅳ類包含17條序列具有較高的相似性，其同源性較高，此類還有其他植物草莓、火龍果。由上述結果可知，冬青衛矛反轉錄轉座子除了物種內的縱向傳遞外，還可能在不同物種間進行橫向傳遞。

圖6 其他植物與冬青衛矛Ty3-gypsy-RT氨基酸(aa)序列進化分析Fig.6 Phylogenetic tree of RT aa sequences of Ty3-gypsy retrotransposons between other plants and E. japonicus

3 結論與討論

植物體內存在大量且類型多樣的反轉錄轉座子。這種可以移動的DNA元件先通過RNA聚合酶合成一條RNA，再經其自身編碼的反轉錄酶反轉錄為cDNA，在整合酶的作用下插入到基因組其他位置，進而改變了目標物種的基因組結構，對進化發揮了巨大作用。前人研究表明，反轉錄轉座子廣泛分布于植物基因組中，且占有極大的比例，其編碼區多存在堿基缺失、重復、替換等各種突變，從而導致物種內基因組序列具有較大差異。本研究所獲得的冬青衛矛Ty1-與Ty3-類反轉錄轉座子RT序列多重比對結果顯示，各類型RT序列相似度普遍偏低，序列平均相似性均為40%左右。其中Ty1-類RT序列EJT1-4與EJT1-7的相似性為8.05%；Ty3-類RT序列EJT3-3與 EJT3-27的相似性為10.04%。產生序列異質性的原因可能是由于轉座子序列中堿基本身在插入新位置時的缺失或移碼突變，使得冬青衛矛LTR反轉錄轉座子RT堿基順序存在一定程度的差異。除此以外，LTR反轉錄轉座子能編碼反轉錄酶與整合酶，其轉座機制與反轉錄病毒(遺傳信息儲存在RNA上)復制和傳播機制相似，與DNA復制不同的是RNA可能缺乏核糖核酸復制酶與轉錄酶的校對修復，使其復制與反轉錄過程中具有較高的突變率。

本研究獲得冬青衛矛Ty1-類和Ty3-類RT序列分別為40條和39條，將其與部分其他物種同種類型反轉錄酶序列進行了系統進化分析。通過進化樹結果可以看出，Ty1-類RT序列分類中的第Ⅰ類里蘋果、李、梨、辣椒等植物與冬青衛矛目標序列的遺傳距離很近，具有較近的親緣關系，其中蘋果AAX56349與EJT1-17、EJT1-18距離最近，可能同源；Ty3-類RT序列分類中馬尾松AGD93162與EJT3-31可能同源，桂花KY401399等與EJT3-9、EJT3-28、EJT3-37等序列具有較近的遺傳距離，可能同源。以上結果表明不同類型的LTR反轉錄轉座子都可能在不同的物種間進行橫向傳遞，才導致他們具有同一起源的關系。