血清miR-29a和miR-200b表達水平在預測三陰性乳腺癌患者預后中的臨床價值

席晨輝

上海市嘉定區江橋醫院/上海市第一人民醫院嘉定分院普外科，上海 201803

乳腺癌作為對女性危害較大的惡性腫瘤，嚴重威脅女性健康，其發病率呈逐年增高的趨勢。三陰性乳腺癌是一種特殊亞型的乳腺癌，主要病理特征為雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮生長因子受體2(HER-2)均為陰性。三陰性乳腺癌的治療手段較為單一，僅以化療為主，缺少其他治療措施；又因其容易出現其他臟器轉移，所以五年生存率不足30%[1]，因此尋找新的治療靶點十分必要[2]。微小RNA(miRNA)是近年來研究的熱點，其在腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移中扮演重要角色，對腫瘤細胞的基因表達具有重要的調控作用，與多種腫瘤的發生、發展和預后均有關[3]。研究發現，在三陰性乳腺癌患者的血清中出現多種miRNA的異常表達，并且發現其對三陰性乳腺癌的病理生理過程具有調控作用，對三陰性乳腺癌的預后亦有重要影響，其中最具代表性的2種miRNA為微小RNA-29a(miR-29a)和微小RNA-200b(miR-200b)[4]。本研究對三陰性乳腺癌患者血清miR-29a和miR-200b表達水平進行檢測，分析其在預測三陰性乳腺癌患者預后中的臨床價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年1月至2018年1月在本院確診為三陰性乳腺癌并行乳腺癌根治術的女性患者98例為乳腺癌組，年齡35～79歲，平均(46.82±4.82)歲；已絕經者58例，未絕經者40例；病理分級：Ⅰ級23例，Ⅱ級63例，Ⅲ級12例；臨床分期：Ⅰ期17例，Ⅱ期34例，Ⅲ期38例，Ⅳ期9例；有淋巴結轉移66例，無淋巴結轉移32例；腫瘤最大徑≤2 cm 39例，>2 cm 59例；Ki-67指數≤15% 26例，>15% 72例。選擇同期在本院行乳腺良性腫塊切除術的女性患者65例為乳腺良性腫塊組，年齡33～76歲，平均(46.02±6.29)歲；已絕經者37例，未絕經者28例。納入標準：患者均行病理診斷確診為三陰性乳腺癌或者乳腺良性腫塊。排除標準：合并其他類型的惡性腫瘤；合并血液疾病或免疫疾病；合并肝炎、結核和肺部感染等急慢性感染；術前經化療、放療和激素治療；合并智力障礙或精神疾病。兩組年齡、絕經情況等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。所有研究對象均簽署知情同意書，本研究經醫院醫學倫理委員會審核通過。

1.2方法

1.2.1血液標本收集 患者于入院當日和手術后7 d抽取肘靜脈血約5 mL，在室溫下靜置約20 min，然后以3 000 r/min離心10 min，離心半徑為15 cm，取上清液約3 mL，放置在-80 ℃的冰箱中保存待測。

1.2.2實時熒光定量PCR檢測血清miR-29a和miR-200b 總RNA的提取：取血清標本10 μL，采用總RNA提取試劑盒提取總RNA,采用紫外分光光度計(UV-3200型)測定標本的吸光度，吸光度設置范圍為1.8～2.0。然后使用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。由上海吉瑪生物科技有限公司設計合成引物序列，miR-29a上游引物5′-ATGCACCTTCGAGCATTGT-3′，下游引物5′-TGTGCGTGTCTATATAC GA-3′；miR-200b上游引物5′-TGCCGTAATACTGCCTGGTAA-3′，下游引物5′-CAGAGCAGGGTCCGAGGTA-3′；內參U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。按照試劑盒說明書進行擴增，總反應體系：上、下游引物各1 μL，Taq DNA聚合酶2 μL，RNase-free ddH2O 4 μL，cDNA 2 μL，SYBR Green Mix 10 μL。循環擴增條件：95 ℃ 19 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 s，45個循環。以U6為參照，用2-ΔΔCt法計算miR-29a和miR-200b的表達水平。

1.2.3隨訪及分組 所有患者術后均隨訪3年。乳腺癌組在術后1個月、3個月、6個月、1年、2年及3年時進行全面檢查[包括胸部CT、乳腺及腹部超聲、頭顱CT及癌胚抗原(CEA)、糖類抗原153(CA153)]，根據檢查結果有無轉移和(或)復發，分為預后不良組和預后良好組。乳腺良性腫塊組在術后每6個月復查一次乳腺超聲。

1.3觀察指標 觀察兩組手術前后血清miR-29a和miR-200b表達水平的變化；分析三陰性乳腺癌患者術前血清miR-29a和miR-200b表達水平與臨床指標及預后的關系；評價術前血清miR-29a和miR-200b表達水平預測三陰性乳腺癌預后的效能；分析三陰性乳腺癌患者術前血清miR-29a和miR-200b表達水平間的相關性。

2 結 果

2.1兩組手術前后血清miR-29a和miR-200b表達水平比較 與乳腺良性腫塊組比較，乳腺癌組術前血清miR-29a表達水平明顯升高，miR-200b表達水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；乳腺癌組與乳腺良性腫塊組術后血清miR-29a、miR-200b表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；乳腺癌組術后血清miR-29a表達水平低于術前，血清miR-200b表達水平高于術前，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組手術前后血清miR-29a和miR-200b表達水平比較

2.2三陰性乳腺癌患者術前血清miR-29a和miR-200b表達水平與臨床指標的關系 術前血清miR-29a和miR-200b表達水平在不同腫瘤最大徑、病理分級、臨床分期和有無淋巴結轉移患者間比較，差異有統計學意義(P<0.05)，而在不同年齡、絕經狀態和Ki-67指數患者間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 三陰性乳腺癌患者術前血清miR-29a和miR-200b表達水平與臨床指標的關系

續表2 三陰性乳腺癌患者術前血清miR-29a和miR-200b表達水平與臨床指標的關系

2.3術前血清miR-29a和miR-200b表達水平與三陰性乳腺癌患者預后的關系 經隨訪，預后不良組有33例，預后良好組有65例。預后不良組術前血清miR-29a表達水平明顯高于預后良好組，miR-200b表達水平明顯低于預后良好組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同預后三陰性乳腺癌患者術前血清miR-29a和

2.4術前血清miR-29a和miR-200b表達水平預測三陰性乳腺癌預后的效能 術前血清miR-29a和miR-200b聯合檢測預測三陰性乳腺癌預后的靈敏度為93.9%，特異度為81.5%，曲線下面積(AUC)為0.917，高于各項單獨檢測。見表4和圖1。

表4 術前血清miR-29a和miR-200b表達水平預測三陰性乳腺癌預后的效能

圖1 術前血清miR-29a和miR-200b單獨及聯合檢測預測三陰性乳腺癌預后的ROC曲線

2.5三陰性乳腺癌患者術前血清miR-29a和miR-200b表達水平的相關性分析 三陰性乳腺癌患者術前血清miR-29a表達水平與miR-200b表達水平呈負相關(r=-0.687，P<0.05)。

3 討 論

三陰性乳腺癌是一種高度異質性的惡性腫瘤，占所有乳腺癌的15%～20%[1]。由于其侵襲性較強，容易發生臟器轉移，且治療手段較為單一，缺乏內分泌治療和靶向治療方法，因此預后較差，治療后3年內復發率高達40%～50%[5]。如何改善三陰性乳腺癌患者的預后已經成為臨床研究的熱點[6]。miRNA作為一種非編碼的單鏈小分子RNA，存在于各種腫瘤細胞中，其在基因轉錄的過程中具有重要的調控作用，能有效調控轉錄后的信息表達，參與細胞增殖、侵襲和轉移過程。

本研究顯示，乳腺癌組術前血清miR-29a表達水平明顯高于乳腺良性腫塊組，并且術后血清miR-29a表達水平較術前明顯降低，說明血清miR-29a表達水平升高與三陰性乳腺癌的發生具有一定的聯系，治療后其水平下降。本研究還發現，三陰性乳腺癌患者術前血清miR-29a表達水平與腫瘤最大徑、病理分級、臨床分期和淋巴結轉移情況有關，而與年齡、絕經狀態和Ki-67指數無明顯關系。腫瘤最大徑越大、病理分級越高、臨床分期越高及發生淋巴結轉移的患者miR-29a表達水平就越高。現已知miR-29a位于人體7號染色體，具體定位為7q32.3，與腫瘤具有密切關系，在多種腫瘤中表現出抑癌因子的作用，如在胃癌[7]、前列腺癌[8]和胰腺癌[9]中呈低表達；然而miR-29a在乳腺癌和結腸癌中呈高表達，表現出促癌因子的作用，對腫瘤的發生、發展起促進作用[10]。研究顯示，miR-29a在體外乳腺癌細胞中呈高表達，并且在發生轉移的乳腺癌細胞中表達水平升高更明顯，認為其與乳腺癌的發生、發展具有十分密切的關系[11]。本研究顯示，三陰性乳腺癌預后不良患者術前血清miR-29a表達水平明顯高于預后良好患者，說明血清miR-29a表達水平與三陰性乳腺癌的轉移、復發具有密切關系。1項體外研究證實，轉染miR-29a后，乳腺癌細胞的增殖和遷移能力明顯增強，而阻斷miR-29a表達后乳腺癌細胞的增殖和遷移能力明顯減弱，說明miR-29a與乳腺癌細胞增殖和遷移有關[12]。本研究結果顯示，當血清miR-29a取截斷值為2.48時，其預測三陰性乳腺癌患者預后的靈敏度為81.8%，特異度為75.4%，AUC為0.820，具有較高的預測價值。

本研究中，術前血清miR-200b在乳腺癌組中的表達水平明顯低于乳腺良性腫塊組，且術后血清miR-200b表達水平較術前明顯升高，說明血清miR-200b表達水平降低可能參與了乳腺癌的發生。現已知miR-200在多種惡性腫瘤(如腎癌、肺癌和卵巢癌)中的表達呈抑制狀態，其可以通過調節內皮細胞間質化從而抑制腫瘤新生血管形成，阻斷腫瘤細胞的增殖和遷移[13-14]。體外實驗證實，在乳腺癌細胞中miR-200b呈低表達，并發現miR-200b可促進乳腺癌細胞凋亡，從而抑制乳腺癌進展[15]。本研究顯示，三陰性乳腺癌患者術前血清miR-200b表達水平與腫瘤最大徑、病理分級、臨床分期和淋巴結轉移情況有關，而與年齡、絕經狀態和Ki-67指數無明顯關系，腫瘤最大徑越小、病理分級越低、臨床分期越低及未發生淋巴結轉移的患者miR-29a表達水平越高。本研究還顯示，預后不良患者術前血清miR-200b表達水平明顯低于預后良好患者，提示血清miR-200b表達水平與患者的預后有關。當血清miR-200b取截斷值為1.08時，其預測三陰性乳腺癌患者預后的靈敏度為93.9%，特異度為70.8%，AUC為0.845，具有較高的預測價值。有研究顯示，與正常乳腺組織比較，乳腺癌組織中miR-200b表達水平較低，且在體外抑制miR-200b表達后乳腺癌細胞的增殖和遷移能力明顯增強[16-17]。本研究還顯示，術前聯合檢測血清miR-29a和miR-200b預測三陰性乳腺癌患者預后的效能明顯高于2項單獨檢測，聯合檢測具有更高的預測價值。相關性分析發現，三陰性乳腺癌患者術前血清miR-29a和miR-200b表達水平呈負相關(r=-0.687，P<0.05)，其具體機制仍需要進一步研究。

綜上所述，血清miR-29a和miR-200b參與了三陰性乳腺癌的發生及發展，且與患者的預后有關，還可用于預后的預測，有望作為三陰性乳腺癌臨床診療的新靶點。