食管鱗狀細(xì)胞癌中SFRP4 表達(dá)水平及臨床意義

黃 濱 王麗萍 林寶泉

1.聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院麻醉科，福建福州 350025；2.聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院心胸外科，福建福州 350025

食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是我國食管癌的主要亞型，占90%以上，5 年生存率只有15%～25%[1-2]。探索新的潛在生物標(biāo)志物可能有助于提高ESCC 的診斷和治療。分泌型卷曲相關(guān)蛋白4（secreted frizzled-related protein 4，SFRP4）是分泌型卷曲相關(guān)蛋白家族的成員之一，通過調(diào)節(jié)Wnt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對細(xì)胞增殖、自我更新和凋亡起重要作用[3-4]。SFRP4 表達(dá)上升促進(jìn)前列腺癌的侵襲能力，且增加腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險[5-6]。本研究探討SFRP4在ESCC 細(xì)胞、血清及組織中的表達(dá)，并探討其臨床價值。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、標(biāo)本

食管鱗狀上皮細(xì)胞系HET-1A 購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；所有ESCC 細(xì)胞系均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。選取2013 年3 月至2015 年4 月聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院（以下簡稱“我院”）病理科存檔的160 例ESCC 及癌旁石蠟組織標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)染色檢測SFRP4 的表達(dá)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理明確為ESCC；②根治性食管癌切除手術(shù)；③臨床病理資料完整，隨訪可靠；排除標(biāo)準(zhǔn)：①腺癌；②因出血、梗阻等急診手術(shù)。收集2019 年6 月至2020 年10 月我院70 例ESCC 患者、70 例Barrett 食管患者和70 名健康體檢者的清晨空腹血清。Barrett 食管由內(nèi)鏡及病理活檢診斷。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器

免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉金橋公司，兔抗人SFRP4 多克隆抗體購自英國NOVUS 公司。

1.3 研究方法

細(xì)胞培養(yǎng)：使用RPMI 1640 培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞株，待生長至70%～80%培養(yǎng)皿進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

Western blot 實驗檢測各組細(xì)胞系中SFRP4 的表達(dá)。提取總蛋白，測定總蛋白濃度，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h，洗膜，一抗過夜孵育，洗膜，二抗孵育，ECL 化學(xué)發(fā)光法顯影。GAPDH 作為內(nèi)參。

免疫組織化學(xué)染色檢測ESCC 及癌旁石蠟組織標(biāo)本中SFRP4 的表達(dá)：切片、脫蠟、水化、修復(fù)抗原、一抗4℃過夜，加二抗，顯色，復(fù)染，封片。SFRP4 陽性表達(dá)定位于細(xì)胞漿。根據(jù)染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞百分比進(jìn)行判定。染色強(qiáng)度：無染色=0 分，淺黃色=1 分，棕黃色=2 分，棕褐色=3 分；染色細(xì)胞百分比：陽性率為0%～10%=1 分，陽性率為11%～50%=2 分，陽性率為51%～75%=3 分，陽性率為＞75%為=4 分。最終評分=染色強(qiáng)度×染色細(xì)胞百分比，0～2 分為低表達(dá)，≥3 分為高表達(dá)。

酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測血清中SFRP4 的表達(dá)量：清晨空腹采集靜脈血5 ml。嚴(yán)格按照試劑盒流程進(jìn)行操作。用酶標(biāo)儀繪制吸光度曲線計算樣本SFRP4水平。

電化學(xué)發(fā)光法檢測癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、鱗狀細(xì)胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCCA）的表達(dá)量：收集清晨空腹靜脈血5 ml，離心后提取血清，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。正常參考值范圍：CEA＜5 ng/L，SCCA＜1.5 ng/ml。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0 對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t 檢驗；計數(shù)資料采用例數(shù)和百分率表示，采用χ2檢驗。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。受試者操作特征曲線計算曲線下面積（area under curve，AUC），采用MedCalc 軟件比較AUC 的差異。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ESCC 細(xì)胞系中SFRP4 的表達(dá)

ESCC 細(xì)胞系的表達(dá)均高于食管鱗狀上皮細(xì)胞系HET-1A（P ＜0.05）。見表1、圖1。

表1 ESCC 細(xì)胞系中SFRP4 的表達(dá)（n=3，）

表1 ESCC 細(xì)胞系中SFRP4 的表達(dá)（n=3，）

注 與食管鱗狀上皮細(xì)胞系HET-1A 比較，aP ＜0.05。ESCC：食管鱗狀細(xì)胞癌；SFRP4：分泌型卷曲相關(guān)蛋白4

2.2 石蠟組織中SFRP4 的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系

ESCC 石蠟組織標(biāo)本中SFRP4 的陽性率為46.9%（75/160），高于癌旁正常組織的15.6%（25/160）（χ2=36.364，P ＜0.001），見圖2。ESCC 組織中SFRP4 的陽性表達(dá)與病理分期有關(guān)（P ＜0.05），見表2。

表2 SFRP4 的表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系（例）

2.3 不同患者血清中SFRP4、CEA、SCCA 的表達(dá)量比較

ESCC 患者血清中SFRP4、CEA 和SCCA 表達(dá)水平高于Barrett 食管和健康體檢者（P ＜0.05）。見表3。

表3 不同患者血清中SFRP4、CEA、SCCA 的表達(dá)量比較（）

表3 不同患者血清中SFRP4、CEA、SCCA 的表達(dá)量比較（）

注 與Barrett 食管患者比較，aP ＜0.05；與健康體檢者比較，bP ＜0.05。SFRP4：分泌型卷曲相關(guān)蛋白4；CEA：癌胚抗原；SCCA：鱗狀細(xì)胞癌抗原；ESCC：食管鱗狀細(xì)胞癌

2.4 血清中SFRP4、CEA、SCCA 及三者聯(lián)合檢測的診斷價值

血清SFRP4、CEA、SCCA 三項聯(lián)合檢測的曲線下面積均高于單獨檢測（Z=3.562、3.197、3.012，P ＜0.05）。見表4、圖3。

表4 血清中SFRP4、CEA、SCCA 及三者聯(lián)合檢測的診斷價值

3 討論

我國ESCC 患者初診時往往處于中晚期，整體生存率仍不高[7-9]。探討ESCC 的發(fā)病機(jī)制，對ESCC 的早期診斷、靶向治療具有重要的臨床應(yīng)用價值。

Wnt 信號傳導(dǎo)通路是指配體Wnt 蛋白和膜蛋白受體結(jié)合激活細(xì)胞內(nèi)下游通道的過程，在調(diào)控多種人體生理活動中起重要作用，Wnt 信號傳導(dǎo)通路失調(diào)是人類多種惡性腫瘤最常見的異常信號之一[10-11]。SFRP4基因位于7 號染色體短臂上，全長10.99 kb，由著絲粒-全端粒方向的反義鏈轉(zhuǎn)錄而成[12]。SFRP4 蛋白C端的網(wǎng)狀蛋白樣結(jié)構(gòu)域與Wnt 配體具有親和力，通過調(diào)節(jié)Wnt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與機(jī)體的發(fā)育和內(nèi)穩(wěn)態(tài)功能[13-14]。近年來，SFRP4 在多種疾病（例如糖尿病、骨性關(guān)節(jié)炎等）發(fā)揮重要作用，并引起廣大學(xué)者的極大關(guān)注[15-17]。

有研究表明SFRP4 在不同惡性腫瘤中的表達(dá)不盡相同。原發(fā)性肝癌患者血清SFRP4 水平顯著高于非肝癌患者[18]。Busuttil 等[19]發(fā)現(xiàn)SFRP4 在胃癌組織中表達(dá)增高，與侵襲性呈正相關(guān)，可作為術(shù)后患者預(yù)后的標(biāo)志物。胰腺癌組織中SFRP4 的表達(dá)水平高于癌旁正常組織，是判斷胰腺癌不良預(yù)后的獨立危險因素[20]。然而，在子宮內(nèi)膜癌中SFRP4 表達(dá)下調(diào)，并與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)[21]。SFRP4 在ESCC 中的表達(dá)尚未報道，本研究判斷SFRP4 與ESCC 間的關(guān)系。

ESCC 的早期診斷對患者的預(yù)后具有重要意義。血清腫瘤標(biāo)志物具有方便、經(jīng)濟(jì)的特點，可用于早期診斷和判斷復(fù)發(fā)的作用[22]。CEA 是一種廣譜腫瘤標(biāo)志物，在ESCC、重度吸煙和肝病中均可升高[23-24]。SCCA 可用于判斷中晚期鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后，但CEA 和SCCA診斷ESCC 的靈敏度和特異度均較差[25-26]。本研究中，SFRP4、CEA、SCCA 三者聯(lián)合檢測的曲線下面積均高于單獨檢測，提示三者聯(lián)合監(jiān)測有利于ESCC 的診斷。本研究中，所有ESCC 細(xì)胞系中SFRP4 表達(dá)量均高于食管鱗狀上皮細(xì)胞系，ESCC 患者血清SFRP4 表達(dá)量高于Barrett 食管和健康體檢者，ESCC 石蠟組織標(biāo)本的SFRP4 陽性率高于癌旁正常組織，顯示SFRP4與ESCC 的發(fā)生有關(guān)。ESCC 石蠟組織SFRP4 的表達(dá)與病理分期有關(guān)，提示SFRP4 促進(jìn)食管的發(fā)展和遷移。

總之，SFRP4 與CEA、SCCA 聯(lián)合檢測有利于提高ESCC 診斷的準(zhǔn)確性，參與ESCC 的發(fā)生、發(fā)展，可作為靶向治療的重要分子標(biāo)志物。