高效液相色譜法測定尿毒清顆粒中3 種成分

趙 磊 李 瓊

安徽省蕪湖市中醫醫院藥劑科，安徽蕪湖 241000

由糖尿病聯盟最新指南可知，全球約有4.63 億糖尿病患者，我國的患者數居全球首位，并呈不斷增長趨勢；同時老齡化的形勢加劇，老年糖尿病患者數也是全球最多的國家[1]。糖尿病腎病的患病率與年齡、病程、血壓、血脂等呈正相關[2-3]，老年患者疾病比較復雜，多合并其他各種慢性疾病，因自身特點，患糖尿病腎病的風險因素較高，有20%～40%的患者合并糖尿病腎病，而糖尿病腎病是終末期腎病的主要原因[4]，對于糖尿病腎病防治方案的研究更加緊迫。隨著中醫藥技術的發展，近年來傳統中醫藥因標本兼治和低毒副作用的優點，使其在腎病治療領域廣受推崇。尿毒清顆粒是純中藥制劑，由黃芪、苦參、制何首烏、大黃、車前草、丹參、白芍等中藥組成。其中大黃、黃芪、川芎和丹參同為君藥，活血祛瘀；制何首烏甘補、增益精血，與白術、黨參、茯苓共為臣藥；白芍與車前草、柴胡、制半夏、菊花為佐藥，養血止痛；甘草作為使藥。該組方對于慢性腎衰竭及糖尿病并發癥等均有良好的治療作用[5-8]。經查閱相關文獻[9-13]，大黃酸、苦參堿、黃芪甲苷、芍藥苷、丹參素及原兒茶醛的測定均有報道，但是對于制何首烏和丹參中重要的活性成分2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（簡稱“二苯乙烯苷”）和丹酚酸B 沒有報道。為保證該制劑的內在質量，本研究改進了芍藥苷的測定方法，采用高效液相色譜法對白芍中的芍藥苷、制何首烏中的二苯乙烯苷、丹參中的丹酚酸B 同時進行含量測定，建立了質量控制方法，為該藥的安全性和有效性提供實驗依據。

1 儀器與試藥

安捷倫1200 高效液相色譜儀；XP-205 分析天平（精度為0.01 mg，Mettler-toledo）；UPS-11-10T 超純水器（成都優普凈化科技）。

乙腈、磷酸為色譜純，其余試劑均為分析純，購于蕪湖市欣志化玻儀器銷售有限公司；自制高純水；對照品：芍藥苷（110736-201640，99.05%），二苯乙烯苷（121190-201204，91.0%），丹酚酸B（121190-201204，94.1%）購于中國食品藥品檢定研究院；尿毒清顆粒（20190105、20201106、20200705、20200105）購于內蒙古康臣藥業；黃芪（210301）購于蕪湖振龍齊欣藥業有限公司；苦參（201001）購于安徽致良中藥飲片有限公司；制何首烏（201102）購于安徽致良中藥飲片有限公司；大黃（2200712T）購于杭州民泰（亳州）中藥飲片有限公司；茯苓（210106）購于亳州市善安堂中藥飲片有限公司；桑白皮（E200801）購于安徽徽草堂藥業飲片股份有限公司；車前草（200801）購于亳州市京皖中藥飲片廠；丹參（2201221X）購于杭州民泰（亳州）中藥飲片有限公司；白芍（201101）購于安徽敬道生物科技有限公司；黨參（210601）購于蕪湖振龍齊欣藥業有限公司；制半夏（D201201）購于安徽致良中藥飲片有限公司；柴胡（201201）購于亳州市慈濟堂中藥飲片有限公司；菊花（201002）購于安徽致良中藥飲片有限公司；甘草（210320）購于亳州市善安堂中藥飲片有限公司；川芎（E210401）購于安徽徽草堂藥業飲片股份有限公司；實驗用藥材經安徽省蕪湖市中醫醫院中藥庫鑒定為正品藥材。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸水，梯度洗脫（0～14 min，19%乙腈；14～15 min，19%→26%乙腈；15～30 min，26%乙腈）；流速1.0 ml/min；檢測波長：0～7 min，230 nm；7～30 min，320 nm；進樣量：10 μl；理論塔板數以二苯乙烯苷計，不得＜3000。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品儲備液 精密稱取芍藥苷、二苯乙烯苷、丹酚酸B 適量；以50%甲醇充分溶解定容至一定體積，制成濃度分別為249.61、123.76、248.42 μg/ml 的混合儲備液。

2.2.2 對照品溶液 取上述儲備液精密稀釋一定倍數，制成芍藥苷、二苯乙烯苷、丹酚酸B 系列濃度的溶液。芍藥苷系列濃度為24.96、49.92、99.84、149.76、199.68、249.61 μg/ml；二苯乙烯苷系列濃度為12.38、24.75、49.50、74.26、99.01、123.76 μg/ml；丹酚酸B 系列濃度為24.84、49.68、99.37、149.05、198.74、248.42 μg/ml。

2.2.3 供試品溶液 取尿毒清顆粒2 袋（20190105），約10 g，于研缽中研細；精密稱定2 g，量取適量的50%甲醇，超聲處理（350 kW，40 kHz）30 min，放冷，濾至50 ml 的容量瓶中，定容；震蕩混勻，靜置，過針式有機濾膜，取續濾液，即得。

2.2.4 陰性供試品溶液 按處方去除白芍、何首烏和丹參外的藥材投料，根據工藝制成缺白芍、何首烏和丹參的陰性供試品，再按“2.2.3”項下制備陰性供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性實驗 取“2.2.2”項下芍藥苷（99.84 μg/ml）、二苯乙烯苷（49.50 μg/ml）、丹酚酸B（99.37 μg/ml）對照品溶液、“2.2.3”項下供試品溶液和“2.2.4”項下陰性供試品溶液；依據“2.1”項下色譜條件檢測峰面積，結果見圖1。供試品中3 個指標成分的分離度均＞1.5；理論塔板數以二苯乙烯苷計，≥3000；同時陰性供試品在3 個指標成分的相應位置上無干擾峰。

2.3.2 線性關系 取“2.2.2”項對照品溶液，依據“2.1”項下色譜條件檢測峰面積；以混合對照品濃度對峰面積作圖，提示芍藥苷在24.96～249.61 μg/ml、二苯乙烯苷在12.38～123.76 μg/ml、丹酚酸B 在24.84～248.42 μg/ml 線性關系良好。見表1。

表1 線性關系方程

2.3.3 精密度 取“2.2.2”項下芍藥苷（49.92 μg/ml）、二苯乙烯苷（24.75 μg/ml）、丹酚酸B（49.68 μg/ml）對照品溶液10 μl，依據“2.1”項下色譜條件檢測峰面積。結果顯示，芍藥苷、二苯乙烯苷、丹酚酸B 峰面積的RSD 值分別為0.9%、1.8%、1.1%，表明精密度良好。

2.3.4 穩定性 取已制備的同一供試品溶液，于室溫下，在0、4、8、12、18、24 h 分別進樣，測定3 個指標成分在各時間點的峰面積，計算各自的峰面積RSD 值。結果顯示，芍藥苷、二苯乙烯苷、丹酚酸B 峰面積的RSD 值均＜2.0%，說明樣品在室溫儲藏條件下24 h 內穩定性良好。

2.3.5 重復性 取尿毒清顆粒（20190105），按照“2.2.3”項下平行制備6 份供試品，依據“2.1”項下色譜條件檢測峰面積，根據外標法分別計算3 個指標成分的平均含量以及RSD 值。結果顯示，芍藥苷、二苯乙烯苷、丹酚酸B 平均含量分別為1.68、0.82、1.92 mg/g；峰面積的RSD 值分別為0.8%、0.5%、1.1%，提示重復性良好。

2.3.6 加樣回收率 取尿毒清顆粒（20190105）10 g，研細，過四號篩，精密稱取6 份，每份1 g，依序精密加入約與含量等量的干燥對照品，按“2.2.3”項下方法制備；依據“2.1”項下色譜條件檢測峰面積，計算加樣回收率。結果顯示，芍藥苷、二苯乙烯苷、丹酚酸B 平均加樣回收率分別為100.21%、100.62%、99.87%；峰面積的RSD 值分別為1.14%、0.58%、0.91%。見表2。

表2 加樣回收率

2.4 不同批次樣品測定結果

精密稱取3 批尿毒清顆粒內容物（20201106、20200705、20200105）2 g，每批平行兩份，按照“2.2.2”項下方法制備，“2.1”項下色譜條件檢測峰面積，通過外標法計算3 個指標成分的含量。見表3。

表3 不同批次樣品測定結果（mg/g）

3 討論

本研究通過紫外光掃描選擇了230、320 nm 的波長分段檢測。針對提取溶劑，考察了50%甲醇和稀乙醇對于含量的提取效率，結果表明稀乙醇與50%甲醇的提取效率接近，但二苯乙烯苷的提取率不如50%甲醇，且雜質干擾變多，因此，選擇50%甲醇作為提取溶劑。

尿毒清顆粒中作用于慢性腎臟病靶點基因多，活性成分多，其中以丹參最多[14]。該制劑為水溶性口服制劑，芍藥苷、二苯乙烯苷、丹酚酸B 在提取的水溶性部位均有良好的呈現[15-17]，故考慮這3 個成分作為指標物，以保障該制劑的有效性，提高了質控手段，降低了實驗成本，經濟性良好。二苯乙烯苷作用廣泛，通過干預基因表達，減輕腎臟損傷；調節內分泌，保護腎小管腎臟[18-20]。丹酚酸B 可以改善腎纖維化，通過上調部分轉錄因子表達保護腎臟，對腎病綜合征有積極的治療作用[21-24]。芍藥苷也能通過抑制糖尿病腎病各通路以及靶點，達到保護腎臟的作用[25-26]。尿毒清顆粒對于腎病的治療效果是否由這3 種成分起關鍵性作用還有待于進一步的研究論證。