“白玉堂”甜瓜的不定芽誘導研究

錢志強，張江波，張月玲

(1.焦作市孟州市鄉村振興局，河南 焦作 454000；2.焦作市中站區龍翔街道辦事處，河南 焦作 454000；3.濟源市農業科學院，河南 濟源 459000)

甜瓜果實香甜，富含糖、淀粉，還有少量蛋白質、礦物質及其他維生素。 據測定，甜瓜除了水分和蛋白質的含量低于西瓜外，其他營養成分均不少于西瓜，而芳香物質、礦物質、糖分和維生素C 的含量則明顯高于西瓜。 多食甜瓜，有利于人體心臟和肝臟以及腸道系統的活動，促進內分泌和造血機能。 甜瓜已成為我國夏季水果類的主銷品。近年來我國甜瓜的栽培面積越來越大，隨之而來的是如何提高甜瓜的人工培養成功率。生產周期長，尤其大棚生產成本高，傳統的培育方法易發生病害，造成種性降低[1]。 為了實現甜瓜種植的規模化、現代化，降低生產成本，組織培養是一項先進有效的途徑。 組織培養在實驗室中進行，比傳統品種改良更為高效。它可以排除其他未知的干擾因素，來研究某一條件（單因素）或某幾個條件（多因素）對該植物的影響，這一條件可以是物理的，如溫度、光照、濕度以及它們的組合，也可以是化學的，如2，4-D、萘乙酸、6-BA 等其他激素或化學成分。 從而得出科學可靠的結論。關于甜瓜的組織培養技術研究的報道雖然較多，但由于各地區之間甜瓜品種差別較大，洛陽地區常見甜瓜品種的組織培養技術報道尚少。

本次試驗以MS 作為基本培養基，以6-BA、IAA組成的16 個激素配比作為誘導培養基，甜瓜白玉堂的組培子葉為外植體，摸索出白玉堂子葉獲得不定芽誘導的激素組合，為開展白玉堂品種組培快繁育苗提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試材料及儀器

甜瓜品種：白玉堂，MS 培養基，6-BA，IAA。 人工氣候箱（MGC-250BP-2），超凈工作臺（SW-CJ-1F），高壓滅菌鍋，微波爐，電子天平（BL210S 北京賽多利斯天平有限公司），冰箱，烘箱，量筒，手術刀，鑷子，封口膜，燒杯，移液管，酒精燈等。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養方案設計。以洛陽地區市場上現售的一種甜瓜品種為試驗材料（白玉堂）。 本試驗設計了16 個誘導不定芽的濃度激素組合。 先對這16 個激素組合進行預培養，篩選出能誘導出不定芽的激素組合，然后對這幾組激素組合進行擴大培養，根據試驗結果對這幾種激素誘導不定芽的誘導率進行對比分析。

種子萌發預培養基：MS 培養基（40 mL 母液Ⅰ+4 mL 母液Ⅱ+4 mL 母液Ⅲ+4 mL 母液Ⅳ+0.4 g 肌醇+12 g 蔗糖+3.2 g 瓊脂粉）。

誘導培養基：MS 培養基 （40 mL 母液Ⅰ+4 mL母液Ⅱ+4 mL 母液Ⅲ+4 mL 母液Ⅳ+0.4 g 肌醇+12 g 蔗糖+3.2 g 瓊脂粉）+不同濃度激素組合的6-BA+IAA，激素組合如下：

處理一：6-BA（0 mg/L）+ IAA（0、0.1、0.5、1.0 mg/L）；

處理二：6-BA（0.1 mg/L）+ IAA（0、0.1、0.5、1.0 mg/L）；

處理三：6-BA（0.5 mg/L）+ IAA（0、0.1、0.5、1.0 mg/L）；

處理四：6-BA（1.0 mg/L）+ IAA（0、0.1、0.5、1.0 mg/L）。

對篩選出來的激素組合進行擴大培養，根據結果對誘導率進行對比分析。

1.2.2 試驗步驟。第一步，培養材料的表面消毒；第二步，甜瓜子葉的預培養；第三步，甜瓜子葉的擴大培養。

（1）種子培養生長5 d 后兩片子葉展開，選擇長勢較好的子葉準備轉接到篩選出來的激素組合。

（2）打開超凈工作臺，準備好轉接所需物品，無菌培養皿，酒精燈，鑷子，手術刀等。

（3）在超凈工作臺的無菌培養皿內將子葉切成約0.5 cm2的方塊，每一子葉切成為兩個外植體，子葉面朝上接種于誘導培養基，每個激素組合接種10 瓶，每瓶4 個外植體。

（4）將接種好的培養基用封口膜封好，然后放入光照培養箱中（條件同上）進行培養。

（5）定期進行觀察，統計出愈傷組織的時間、出芽時間、出芽個數、分析出芽率、褐變數。

2 結果與分析

2.1 甜瓜不定芽誘導培養基的初步篩選

甜瓜子葉外植體在芽誘導培養基上不斷擴大，3～5 d 左右，外植體在切口處長出細小、鮮綠、生長旺盛的愈傷組織（圖1），10～13 d 外植體愈傷組織處開始長出芽叢，出芽部位多集中在外植體近胚軸一端，另一端很少有愈傷組織的生成。 30 d 后統計出芽率。

初步篩選白玉堂甜瓜品種誘導不定芽的培養基激素組合（表1），根據試驗結果分析可知，不同的激素組合對子葉不定芽的誘導產生不同的影響，芽的誘導與6-BA 和IAA 兩種激素的配比密切相關。試驗表明，只有 （6-BA、IAA）：（0.5 mg/L、1.0 mg/L）、（1.0 mg/L、0.5 mg/L）、（1.0 mg/L、1.0 mg/L）這3 個激素組合能使甜瓜白玉堂子葉誘導產生不定芽。

表1 預培養的篩選結果

將初步篩選出來的激素組合 （6-BA、IAA）：（0.5 mg/L、1.0 mg/L）、（1.0 mg/L、0.5 mg/L）、（1.0 mg/L、1.0 mg/L）進行擴大培養，分別標為擴大1、擴大2、擴大3。根據實驗結果分析可知（表2），擴大2 的子葉不定芽誘導率最大為37.5%，擴大1 的不定芽誘導率為22.5%，擴大3 的不定芽誘導率為30%。

表2 擴大培養不定芽誘導的試驗結果

2.2 激素對不定芽誘導的影響

一般認為培養基中較高濃度的細胞分裂素和低濃度的生長素是不定芽分化所必需的。但兩者要有合適的配比，否則會出現嚴重的褐化現象。 本試驗也充分證實了這一觀點。 在植物的組織培養中，確立最佳誘導條件是十分必要的，尤其是植物激素的濃度。 根據圖2 可以看出，本研究甜瓜品種“白玉堂”最適宜的培養基為擴大2 （MS+6-BA 1.0 mg/L +IAA 0.5 mg/L）。為了使不定芽的分化保持較高的頻率，加入較高濃度范圍的6-BA 和低濃度的IAA 對芽的分化有促進作用，但若6-BA 濃度太高，不管IAA 濃度多大，都會明顯抑制芽的分化，幾乎沒有不定芽的產生。

2.3 不定芽誘導過程褐化情況

在甜瓜白玉堂子葉不定芽誘導試驗中，有褐變現象產生（圖3），褐變的產生和激素濃度的配比有密切的聯系。 根據試驗結果分析可知（圖4），擴大1 和擴大3 相比較IAA 一定，隨著6-BA 濃度的增大，褐變數也在增多；擴大2 和擴大3 相比較，在6-BA 濃度一定的情況下，隨著IAA 濃度的增大，褐變數不斷增大；擴大1 和擴大2 相比較，根據試驗結果可知，擴大2 的激素組合是最佳誘導不定芽的組合，因此由上述可知，6-BA 的濃度過高或過低都會使褐變數增多，IAA 濃度過高或過低都會使褐變數增多。

3 討論

在甜瓜組織培養植株再生方面，目前已能夠通過子葉、下胚軸、真葉等外植體再生出完整植株，但由于甜瓜品種較多，不同的甜瓜品種基因型相差較大，因此不同甜瓜品種的組培再生潛力依基因型表現出明顯不同。 肖守華等[2]曾以優質厚皮甜瓜品種魯厚甜2號和魯厚甜4 號為材料，系統研究了以子葉為外植體的厚皮甜瓜組培高效再生體系。 結果表明：兩個甜瓜品種在不定芽和愈傷組織誘導上存在著較大的差異，在MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L 的分化培養基上，魯厚甜2 號不定芽誘導率最高達92.6%；而魯厚甜4 號在MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L 中達94.3%。 Dong 等[3]和Yalcin-Mendi 等[4]曾經分別報道了在西瓜組織培養時，當6-BA 同低濃度的IAA 同時使用時會促進幼芽的形成，然而，Srivastava 等[5]發現了在西瓜子葉培養中NAA 或IAA 的加入會抑制不定芽的形成。 Krug 等[6]報道了當TDZ 或NAA 同BA 同時使用同樣降低了西瓜子葉不定芽的誘導率。

在甜瓜組織培養誘導不定芽方面，目前已經通過子葉誘導產生不定芽，一般認為培養基中較高濃度的細胞分裂素和低濃度的生長素是不定芽分化所必需的；在相反的配合時，則有利于根的分化，在愈傷組織和不定芽分化階段需較高的細胞分裂素，待分化出不定芽后就應降低細胞分裂素濃度，以利于芽的生長。本試驗也充分證實了這一觀點。擴大2 就是6-BA 濃度高、IAA 濃度低，結果就使不定芽的誘導數高。在植物的組織培養中，確立最佳誘導條件是十分必要的，尤其是植物激素的濃度。本研究發現，甜瓜品種“白玉堂”最適宜的培養基為擴大2（MS+ 6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.50 mg/L）。 當降低6-BA 濃度或者升高IAA濃度都會使誘導率降低而且會使褐化數增多。

甜瓜子葉在培養過程中有明顯的極性現象和敏感部位，即甜瓜子葉的近軸端和遠軸端在誘導過程中的表現不同，不定芽總在近軸端切口部位產生，該現象可能與內源激素在外植體的分布與積累有關，未成熟子葉是甜瓜離體培養的最佳外植體，不僅再生能力強，不定芽分化率高，而且對培養基的適應性也較廣[7]。 本試驗以5 d 苗齡的甜瓜子葉誘導容易產生不定芽。

褐化的原因主要是植物組織經創傷后產生大量的酚類化合物，氧化后褐化造成。加氧化劑、活性炭等均可減緩褐化的發生，我們的試驗結果發現，低濃度的6-BA 不但利于不定芽的誘導，而且畸形芽少，還可以減緩褐化程度；隨著6-BA 濃度的升高，褐化組織數目增加，褐化程度越重。 可能是由于細胞分裂素刺激了多酚氧化酶的活性所致。 所以，我們在甜瓜的組織培養過程中，在篩選了高效誘導再生的激素后，發現褐變現象時，應及時根據具體情況，采取有效的措施，減少褐化程度。

4 結論

在設置的16 個激素組合中，只有擴大1(6-BA、IAA)：（0.5 mg/L、1.0 mg/L）、擴大2(6-BA、IAA)：（1.0 mg/L、0.5 mg/L）、 擴大3 (6-BA、IAA)：（1.0 mg/L、1.0 mg/L） 可以誘導出不定芽。 可通過擴大培養結果分析得出激素組合為MS 培養基+6-BA（1.0 mg/L）+IAA（0.5 mg/L）（pH 5.8）為白玉堂不定芽誘導最佳激素組合培養基。 通過擴大培養可知，褐變數和激素配比濃度有關，擴大2 的激素配比組合誘導，褐變數最少。