二苯乙烯苷對阿爾茨海默病小鼠CDK5、MAPK1、PP1的調控作用

吳文雪 蘇彥兆 李振中 劉超宇 蒙婉瑩 黃健 朱曉瑩 劉家碧 劉東明 黃忠仕

(1右江民族醫學院基礎醫學院，廣西 百色 533000；2廣西中醫藥大學藥學院；右江民族醫學院 3藥學院；4臨床醫學院；5文山州人民醫院腫瘤科放療中心)

阿爾茨海默病(AD)發病早期以進行性認知功能障礙為主要表現，隨著病情進展還可表現為冷漠、幻想、狂躁等精神問題〔1〕。AD發病機制尚未完全清楚，研究表明AD發病機制與Tau蛋白過度磷酸化密切相關，如何最大限度抑制Tau蛋白過度磷酸化被認為是治療AD的關鍵〔2，3〕。

二苯乙烯苷(TSG)具有抗炎、抗衰老、抗凋亡、增長記憶和清除自由基等功效〔4〕，研究表明TSG能延緩退行性神經疾病〔5，6〕，細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)5、細胞外蛋白調節激酶(MAPK)1、蛋白磷酸酶(PP)1參與Tau蛋白的異常磷酸化〔7～9〕，因此CDK5、MAPK1、PP1表達水平可能與AD的發病機制有關。但TSG能否在動物水平通過影響CDK5、MAPK1及PP1，調控AD小鼠Tau蛋白磷酸化水平達到抗AD的目的尚未見報道，本研究以淀粉樣前體蛋白(APP)/早老蛋白(PS)1/Tau三轉基因(3×Tg)-AD小鼠為研究對象，探討TSG抗AD的可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 SPF級雄性3×Tg-AD小鼠45只購自美國Jackson Laboratory(健康證書編號：1911A18008)，6周齡，體重(25.02±0.20)g；相近遺傳背景的SPF級雄性小鼠C57BL/6J 9只購自長沙市天勤生物技術有限公司〔生產許可證號：SCXK(湘)2019-0011〕，6周齡，體重(25.20±0.16)g；TSG購自成都克洛瑪生物科技有限公司〔批號CHB180810，純度≥70%〕；陽性藥即石杉堿甲片購自辰欣藥業股份有限公司(批號國藥準字H20093133，50 μg/片)；CDK5抗體(批號：00041207)、MAPK1抗體(批號：00077469)、PP1抗體(批號：10008903)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(批號：00083125)、抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒(批號：30202004)、山羊抗小鼠IgG二抗(批號：20000175)及山羊抗兔IgG二抗(批號：20000174)均購美國Proteinech Group公司；β-actin抗體(批號：UD277186)購自美國Invitrogen公司；P39抗體(批號：AG08022014)購自北京博奧森生物技術有限公司；Omini-ECLTM超靈敏感化學發光檢測試劑盒(批號：02391063)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(批號：013B1050)、牛血清白蛋白(BSA，批號：013C1028)均購自雅酶品牌；高效放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液(批號：20190922)購自美國Solarbio公司。

1.2方法

1.2.1動物分組與給藥 所有小鼠統一飼養于廣西百色右江民族醫學院SPF級別動物實驗中心，8月齡開始給藥處理，SPF級別實驗室提供的環境為：室溫20～25℃，濕度55%～75%，小鼠自由進食、飲水。將45只8月齡3×Tg-AD小鼠隨機分成5組：模型組(生理鹽水)，陽性對照組(石杉堿甲，0.150 mg/kg)，TSG低劑量組(TSG，0.033 g/kg)，TSG中劑量組(TSG，0.100 g/kg)，TSG高劑量組(TSG，0.300 g/kg)，再選取C57BL/6J雄性小鼠9只作為正常對照組(生理鹽水)，灌胃容積均為10 ml/kg；1次/d，連續給藥60 d，本研究藥物的劑量使用參考本課題前期已發表文獻的數據〔10〕。本研究經醫院倫理委員會審批，實驗過程中對動物的處置符合《關于善待實驗動物的指導性意見》宗旨。

1.2.2免疫組織化學(IHC)染色 小鼠頸椎脫臼處死，冰上操作取出整個大腦，常規固定、脫水、包埋、石蠟切片(厚度4 μm)、烤片，常規脫蠟、高壓修復2 min冷卻至室溫，3%過氧化氫封閉10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min，重復3次，血清封閉1 h，P39一抗(1∶400)4℃過夜，PBS沖洗5 min，重復3次，二抗室溫孵育30 min，二氨基聯苯胺(DAB)顯色1 min加PBS沖洗終止反應。常規復染、脫水、透明、封片后用正置熒光顯微鏡觀察并拍照，觀察各組大腦皮層、海馬P39蛋白表達水平。

1.2.3實時熒光定量-聚合酶鏈反應(qRT-PCR) 迅速處死小鼠，冰上操作取出整個大腦保存于液氮，腦組織用液氮研磨，參照AxyPrep總RNA小量制備試劑盒說明書提取RNA，提取的 RNA按試劑盒步驟進行去DNA和逆轉錄，采用兩步法以qRT-PCR儀進行擴增。反應體系(共20 μl)：上/下引物各1 μl、模板cDNA2 μl、通用型快速反應SYBR綠色熒光染料混合物10 μl、無酶水6 μl。反應條件：95℃預變性600 s；95℃變性10 s，60℃延伸30 s，共40個循環。以GAPDH 為內參，采用2-ΔΔCt法計算各目的mRNA的相對表達量。CDK5上游引物：5′-CCCTGAGATTGTGAAGTCATTCC-3′，下游引物:5′-CCAATTTCAACTCCCCATTCCT-3′；MAPK1上游引物:5′-TTGCTTTCTCTCCCGCACAAA-3′，下游引物:5′-AGAGCCTGTTCAACTTCAATCC-3′；PP1上游引物:5′-AGAGAACGAGATCCGTGGTCT-3′，下游引物:5′-ACAGCCGTAGAAGGTCATAGT-3′；GAPDH上游引物:5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，下游引物:5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3′。

1.2.4Western印跡 標本取材及保存同1.2.3，使用液氮研磨腦組織，按照每200 mg腦組織加蛋白裂解液(RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑按體積比100∶1)2 ml于冰上充分裂解30 min，4℃ 12 000 r/min離心5 min，收集上清液，用 BCA法測定蛋白濃度后，再用5×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液稀釋，于95～100℃變性6 min存放于-80℃。按每孔上樣量80 μg組織提取液行SDS-PAGE，然后在180 mA、室溫條件轉移60 min至NC膜上；將膜置于QuickBlockTMWestern封閉液中，搖床上振搖10 min封閉；TBST洗3次，10 min/次，然后分別加入CDK5(稀釋比例均為 1∶1 000)、MAPK1(稀釋比例均為 1∶2 000)、PP1和β-actin(稀釋比例均為1∶5 000)、GAPDH(稀釋比例為 1∶6 000)于4℃孵育過夜；以TBST 洗3次，10 min/次，加入相應的二抗(稀釋比例均為1∶5 000)，4℃ 避光環境振搖1 h，再次用TBST洗3次后，以超靈化學發光液進行發光顯色，采用ImageJ v1.8.0版本軟件測定條帶灰度值。其中CDK5和MAPK1以GAPDH為內參，PP1以β-actin為內參，統計目的蛋白條帶與內參蛋白條帶吸光度的比值表示目的蛋白的表達水平。

1.3統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.1各組大腦皮層及海馬區P39 IHC染色 正常對照組大腦皮層、海馬區有少量P39表達，陽性反應物顏色較淺；與正常對照組比較，模型組P39廣泛表達于大腦皮層及海馬區，陽性反應物染色深；與模型組比較，陽性對照組及TSG各劑量組P39較少表達于大腦皮層及海馬區，陽性反應物染色較淺；與陽性對照組比較，TSG各劑量組P39表達于大腦皮層及海馬區的量無明顯變化，陽性反應物染色無明顯變化，見圖1、圖2。

2.2qRT-PCR檢測各組陽性神經元細胞 與正常對照組比較，其余各組海馬區、大腦皮層P39平均光密度值和陽性神經元細胞總數目顯著增多(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組及TSG各劑量組海馬區、大腦皮層P39平均光密度值和陽性神經元細胞總數目顯著降低(P<0.05)；與陽性對照組比較，TSG高劑量組大腦皮層、海馬區P39陽性細胞總數目顯著降低(P<0.05)，見表1。

2.3各組CDK5、MAPK1及PP1 mRNA表達 與正常對照組比較，其余各組CDK5、MAPK1 mRNA轉錄水平顯著增高(P<0.05)，PP1 mRNA轉錄水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，TSG各劑量組CDK5 mRNA轉錄水平顯著降低(P<0.05)，陽性對照組及TSG各劑量組MAPK1 mRNA轉錄水平顯著降低(P<0.05)，TSG各劑量組PP1 mRNA轉錄水平顯著增高(P<0.05)；與陽性對照組比較，TSG高劑量組CDK5 mRNA轉錄水平顯著降低(P<0.05)，TSG高劑量組PP1 mRNA轉錄水平顯著增高(P<0.05)，見表2。

2.4各組CDK5、MAPK1及PP1蛋白表達 與正常對照組相比，其余各組CDK5、MAPK1蛋白表達顯著增高(P<0.05)，PP1蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組及TSG各劑量組CDK5、MAPK1蛋白表達顯著降低，PP1蛋白表達顯著增高(P<0.05)；與陽性對照組比較，TSG高劑量組MAPK1蛋白顯著降低(P<0.05)，TSG中、高劑量組PP1蛋白表達顯著增高(P<0.05)，見表2、圖3。

圖1 各組大腦皮層P39表達(IHC，×400)

圖2 各組海馬區P39表達(IHC，×400)

表1 P39的光密度和IHC陽性神經元細胞表達

表2 各組CDK5、MAPK1及PP1 mRNA及蛋白表達

1～6 : 正常對照組，模型組，陽性對照組，TSG低劑量組，TSG中劑量組，TSG高劑量組圖3 各組CDK5、MAPK1和PP1蛋白表達

3 討 論

AD主要病理特點為細胞內Tau蛋白異常磷酸化聚集、細胞外β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積伴隨一定數量突觸及神經元的丟失〔11，12〕。TSG是名貴藥材何首烏提取物的主要活性成分之一，其因抗炎、抗衰老等重要功效在各種退行性疾病中有極高的應用價值〔13，14〕，前期研究表明TSG有良好的抗AD作用〔10〕。

CDK5和MAPK1在參與調控神經細胞的遷移、生長等方面都有重要作用〔15〕。P39作為CDK5依賴激活劑，在參與CDK5調控神經細胞分化、髓鞘修復等生理功能發揮重要作用〔15〕。Tau的重要生理功能是協助微管蛋白組裝到微管和維持微管的穩定。病理情況下，過度磷酸化Tau蛋白可通過異常構象增加自我聚集的能力，阻礙神經元的傳輸系統，加重AD〔16〕。PP1作為蛋白磷酸酶家族中的重要一員，參與機體的去磷酸化反應，Oliveira等〔9〕研究發現PP1的活化增強可降低神經元Tau蛋白的磷酸化水平。生理情況下，Tau蛋白在蛋白激酶和蛋白磷酸酶的相互調節下處于磷酸化和去磷酸化的動態平衡狀態，當蛋白激酶表達上調和(或)蛋白磷酸酶下調時這種平衡會被打破，表現為AD〔17〕。本研究結果發現給予TSG低、中、高劑量處理后小鼠的MAPK1、CDK5和P39蛋白同模型組比較顯著下調，這與研究〔18，19〕結果一致；給予TSG低、中、高劑量處理后小鼠的PP1蛋白同模型組比較顯著上調。結果表明TSG對3×Tg-AD小鼠具有一定的改善作用。

綜上，本研究證實TSG對3×Tg-AD小鼠具備一定改善作用，其作用機制可能與下調CDK5和MAPK1轉錄和表達、上調PP1轉錄與表達，抑制Tau蛋白磷酸化有關。