參麥方對心肌細胞糖脂毒性損傷的保護作用

關婉辰 戴璐彬 張棟 周凱旋 劉佳 鮑慧瑋 李麗靜 (長春中醫藥大學，吉林 長春 130117)

老年2型糖尿病(T2DM)患病率逐年增加〔1〕，因此對于糖尿病的改善和控制已勢不可擋。T2DM患者常伴有血糖血脂代謝異常，導致長期高血糖和高血脂在體內堆積，產生的糖脂毒性對機體多組織器官造成損傷，其中對心肌功能的危害最大，為研究天然藥物改善糖脂毒性損傷的發病機制，本文選用古典名方參麥方進行研究，參麥方中人參和麥冬可等分同用，都能益氣養陰，潤肺清心〔2〕，參麥方注射劑型已被臨床證實能改善T2DM大鼠的心功能〔3〕，為模擬細胞在體內高糖高脂環境和出于對用藥的長期性考慮，本研究選用參麥方口服劑型在體外建立H9C2細胞糖脂損傷模型，探討參麥方對大鼠心肌細胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗細胞 H9C2大鼠心肌細胞：北京協和細胞資源中心提供。

1.2實驗藥物

1.2.1參麥方含藥血清制備 15只雄性SD大鼠隨機分為空白組、參麥方低、高劑量組，每組5只。空白組給予蒸餾水，參麥方低、高劑量組分別按照1.1 g/kg、5.4 g/kg給予自制參麥方水煎液灌胃，連續3 d，3次/d，末次給藥1 h后，20%烏拉坦麻醉，腹主動脈取血，離心取上清液，滅活過濾備用。

1.2.2主要溶液制備 棕櫚酸溶液：取10 ml超純水勻速加入0.209 g棕櫚酸鈉，水浴加熱至70℃溶解，即配制成0.075 mol/L 棕櫚酸水溶液，同時在30 ml超純水中加入6 g牛血清白蛋白(BSA)緩慢攪拌加熱至完全溶解，配制 20%的BSA水溶液，將3 ml 0.075 mol/L棕櫚酸水溶液緩慢滴加到20%BSA水溶液中，70℃加熱攪拌，充分交聯后，制成7.5 mmol/L的棕櫚酸溶液，迅速使用0.22 μm濾膜過濾除菌，放于4℃冰箱保存備用。葡萄糖溶液：稱取1.8 g葡萄糖，吹打溶解于超純水中，制備成1 mol/L的葡萄糖儲備液，在超凈臺中使用0.22 μm濾膜過濾除去細菌和雜質，分裝后保存于4℃冰箱。

1.3主要材料與試劑 人參(批號：200301，北京同仁堂健康藥店)、麥冬(批號：20190301，北京同仁堂健康藥店)、棕櫚酸(批號：SLBD2406V，Sigma公司)、葡萄糖(批號：D9434，Sigma公司)、乳酸脫氫酶試劑盒(批號：20190523，南京建成生物工程研究所)、Hoechst33258染色試劑盒(批號：1224192009-08，碧云天)。

1.4H9C2細胞糖脂毒性模型的建立 H9C2細胞接板培養后，加入不同濃度梯度的棕櫚酸(0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.75、1.00 mmol/L)和葡萄糖(10、20、30、40、50 mmol/L)，并設立正常對照組，干預24 h后，每孔加入10 μl CCK8，1 h后450 nm波長下檢測每孔OD值，計算細胞存活率，選取棕櫚酸與葡萄糖最適殺傷濃度，建立H9C2糖脂毒性模型。同等方法加入不同濃度梯度的參麥注射液(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mg/ml)計算細胞存活率，選取參麥注射液的最適給藥劑量進行后續實驗。

1.5H9C2細胞糖脂毒性損傷的檢測

1.5.1參麥方含藥血清對糖脂毒性損傷的H9C2細胞存活率影響 H9C2細胞以體積100 μl/孔,密度5×103個/孔，“蛇形順序”接種在96孔板中，使用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM高糖培養基培養細胞，24 h后棄培養液，分組給藥，細胞分為正常對照組(含10%空白大鼠的血清的DMEM高糖培養液)、糖脂模型組(10%空白大鼠血清+0.40 mmol/L棕櫚酸和30 mmol/L葡萄糖的DMEM高糖培養液)、參麥注射液組(10%空白大鼠血清+0.40 mg/ml參麥注射液)、參麥方低劑量組(10%參麥方低劑量大鼠血清+0.40 mmol/L棕櫚酸和30 mmol/L葡萄糖的DMEM高糖培養液)、參麥方高劑量組(10%參麥方高劑量大鼠血清+0.40 mmol/L棕櫚酸和30 mmol/L葡萄糖的DMEM高糖培養液),給藥干預后酶標儀檢測細胞存活率。

1.5.2磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、磷酸化(p)-蛋白激酶B(AKT)/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表達檢測 Western印跡檢測蛋白PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR。最終以內參GAPDH的灰度值比值進行統計學分析。

1.5.3形態學觀察H9C2細胞凋亡 細胞接種6孔板給藥處理后，按 Hoechst 33258 試劑盒方法每孔加入150 μl 5 μg/ml染色液進行避光染色，最終使用熒光顯微鏡觀察拍照。

1.5.4H9C2細胞的凋亡蛋白B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、活性半胱天冬酶(Cleaved-Caspase)3表達檢測 同1.5.2方法檢測凋亡蛋白Cleaved-Caspase3、Bax、Bcl-2。

1.6統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1H9C2細胞糖脂毒性模型的建立

2.1.1H9C2細胞脂毒性濃度篩選 與正常對照組相比，棕櫚酸組存活率呈劑量依賴性下降，其中0.40 mmol/L棕櫚酸組存活率達69.4%，損傷程度可緩，實驗重復性穩定，因此選用0.40 mmol/L棕櫚酸來建立脂毒性損傷模型。見表1。

表1 棕櫚酸最適濃度篩選

2.1.2H9C2細胞糖毒性濃度篩選 與正常對照組比較，葡萄糖組存活率呈劑量依賴性下降，30 mmol/L條件下葡萄糖損傷可緩，因此選用30 mmol/L葡萄糖來建立糖毒性損傷模型。見表2。

表2 不同高糖濃度下損傷H9C2心肌細胞存活率的影響

2.1.3參麥注射液給藥濃度篩選 與正常對照組相比，參麥注射液組在0.4 mg/ml條件下，H9C2細胞存活率最高(P<0.01)。見表3。因此選用0.4 mg/ml濃度進行后續實驗。

表3 參麥注射液對H9C2心肌細胞存活率的影響

2.2參麥方含藥血清對H9C2細胞糖脂毒性模型存活率的影響 與正常對照組比較，糖脂模型組存活率降低具有統計學意義(P<0.01)；與糖脂模型組比，各給藥組存活率顯著上升(P<0.01或P<0.05)，初步說明參麥方對糖脂毒性損傷的心肌細胞具有改善作用。見表4。

2.3形態學觀察H9C2細胞凋亡 正常對照組細胞核有序勻稱排布，核邊緣柔和光滑散發淡藍色光；與正常對照組比，糖脂模型組核大小不一，可見較多固縮，部分細胞核成片狀分開，胞核染色加深，可見明顯玻珠樣病變；與糖脂模型組相比，各給藥組細胞核玻珠樣病變減弱呈淡藍色光，核收縮情況緩解，說明糖脂毒性可能誘導細胞凋亡，經參麥方含藥血清干預后可改善細胞凋亡。見圖1。

2.4H9C2細胞的PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表達檢測 與糖脂模型組相比，各給藥組PI3K、p-AKT/AKT蛋白明顯升高，p-mTOR/mTOR蛋白表達顯著降低(P<0.01或P<0.05)；說明參麥方含藥血清可能調控了PI3K/AKT/mTOR通路。見表4、圖2。

表4 參麥方對糖脂毒性模型存活率、PI3K/AKT/mTOR通路蛋白及凋亡蛋白表達的影響

圖1 參麥方含藥血清Hoechst33258染色后H9C2細胞生長狀態(×200)

2.5H9C2細胞的Cleaved-Caspase3、Bax、Bcl-2蛋白表達檢測 與糖脂模型組相比，各給藥組抗凋亡蛋白Bcl-2顯著升高(P<0.05，P<0.01)，促凋亡蛋白Bax和Cleaved-Caspase3表達水平顯著下降(P<0.05，P<0.01)，說明參麥方含藥血清可減緩心肌細胞凋亡，改善心肌功能。見表4、圖3。

1～5：正常對照組，糖脂模型組，參麥注射液組，參麥方低劑量組，參麥方高劑量組；圖3同圖2 參麥方含藥血清對H9C2細胞糖脂毒性模型PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表達

圖3 參麥方含藥血清對H9C2細胞糖脂毒性模型凋亡蛋白表達

3 討 論

T2DM是一種代謝紊亂性疾病，與年齡的影響有著不可分割的關系，年齡的增長導致糖尿病高發，對于老年人生活習慣干預可減緩糖尿病前期發展〔4〕，但未能解決根本問題，因此需探求天然藥物討論其作用機制減緩糖尿病的產生和發展。因此本文從糖脂毒性角度出發，對參麥方改善糖脂損傷對心肌細胞的影響進行探究。

目前最為公認的使細胞造成脂毒性損傷應用最廣泛的分子是棕櫚酸〔5～12〕，因此本研究中給予棕櫚酸酯和葡萄糖刺激，建立心肌細胞糖脂損傷模型，通過細胞毒CCK8檢測存活率，并通過形態學染色觀察細胞凋亡情況，最終發現經參麥方干預后心肌細胞凋亡減少。而心肌細胞受損的同時發生的多種特征不僅包括細胞凋亡和壞死，還包括自噬。自噬和凋亡之間的平衡維持體內平衡。自噬的失活可能導致異常蛋白質和細胞器積聚，從而促進細胞凋亡或壞死。 所以自噬和凋亡在心肌細胞生長過程扮演重要作用〔13〕。研究發現，在中藥活性成分干擾下能使心臟組織PI3K蛋白上調，從而激活PI3K/AKT通路，達到對糖尿病大鼠心肌損傷的保護作用，其下游mTOR蛋白磷酸化可影響細胞自噬凋亡等生物活動〔14,15〕，Bcl-2是抗凋亡蛋白,Bax是促凋亡蛋白，這兩個蛋白可互相協同發揮作用，對心肌細胞凋亡起著決定性作用,Caspase3是凋亡執行因子之一，是凋亡通路的必經途徑，活化的Caspase3被激活可導致心肌細胞凋亡,三者對T2DM狀態下造成的心臟損傷引起的心肌細胞凋亡有著關鍵作用〔16,17〕。參麥方是中國傳統的中藥復方，具有很好的抗凋亡作用，但是參麥方抗凋亡作用的機制尚不明確。因此通過參麥方干預后對大鼠心肌細胞進行蛋白檢測，結果發現與模型組比較，各給藥組PI3K、AKT/p-AKT蛋白上調，p-mTOR/mTOR蛋白下調，同時發現與模型組比較，各給藥組促凋亡蛋白下調，抗凋亡蛋白上調。

綜上所述，參麥方可能通過調控PI3K/AKT/mTOR 通路促進自噬產生從而抑制凋亡，改善心肌細胞損傷，從而起到對糖脂毒性損傷的心肌細胞保護作用，也為后續深入研究參麥方影響心肌細胞自噬和凋亡的作用機制提供理論依據。