基于腦-腸軸探討補腎潤腸方對老年慢傳輸型便秘大鼠結腸AQP3、AQP9表達的影響

左振魁 韓佳瑞 計樹靈 賀露露

(1河南省中醫院(河南中醫藥大學第二附屬醫院)，河南 鄭州 450000；2河南中醫藥大學)

近年來，便秘發生率逐漸增加，已成為影響人們健康的常見疾病〔1〕。結腸的傳導功能出現異常，致使攝入的食物在腸道中大量貯存，或通過腸道的時間延長，從而引起慢傳輸型便秘〔2〕。臨床治療慢傳輸型便秘時，多選擇瀉藥，癥狀未緩解者再予以手術，但存在藥物不良反應、手術并發癥等問題，效果有待于進一步提高。補腎潤腸方為河南省中醫院治療慢傳輸型便秘的協定方，由經典方劑簡化改進而來，補腎潤腸方對慢傳輸型便秘患者病情的改善效果顯著，但其機制仍不明確。現代研究發現中樞神經系統、腸神經系統及椎前神經節共同對胃腸運動闡釋調控作用，腦部中樞系統、脊髓是接收信息及整合信息的重要器官，通過神經-內分泌系統及自主神經系統對調控信息進行傳輸，使其進入腸神經系統，并對胃腸效應細胞產生調控作用，促使胃腸道充分使用內部環境、外部環境的變化，從而促使其生理功能的實現〔3〕。此連接中樞神經系統、胃腸道系統的神經-內分泌網絡即為腦-腸軸，于腸道功能的調控中，腦-腸軸的雙相信號傳導功能尤其關鍵〔4〕。本研究基于腦-腸軸探討補腎潤腸方對慢傳輸型便秘水通道蛋白(AQP)3、AQP9的作用機制。

1 材料與方法

1.1動物與材料 選取85只成年健康SPF級SD大鼠，均由上海杰思捷實驗動物有限公司提供，18～20月齡，體重200～220 g，均在相同條件下進行飼養，溫度20～25℃，濕度50%～65%，且在飼養期間保證12 h的光暗條件循環，本研究已獲得動物倫理委員會批準。補腎潤腸方劑：熟地黃、白術及山茱萸各20 g，肉蓯蓉、瓜蔞仁、懷牛膝、火麻仁、當歸、萊菔子、何首烏、杏仁及枳殼各15 g，為保證飲片的質量，由同仁堂有限公司藥師對研究用藥進行鑒定，且均證實為正品。伊托必利(山東信誼制藥，H37023049)，復方聚乙二醇電解質散〔舒泰神(北京)生物制藥，H20040034〕；蘇木素(北京索萊寶科技有限公司，H8070)，二氨基聯苯胺顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，ZLI-9032)，由英國Abcam公司提供AQP3兔多克隆抗體；由SantaCruz公司提供AQP9兔多克隆抗體及目的基因一抗；由Epigentek集團公司提供山羊抗兔二抗；總RNA抽提試劑(美國Invitrogen公司，16596-026)；β-actin鼠單克隆抗體(英國Abcam公司，ab8226)。

1.2儀器 BX50型光學顯微鏡(OLYMPUS)，902ULTS型-80℃冰箱(美國Thermo)，Thermo3111型CO2培養箱(美國Thermo)，5804R型離心機(德國Eppendorf)，EG1160型包埋機(LEICA)，RM2245型切片機(LEICA)，由美國Bio-Rad公司提供CFX96型實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)擴增儀；由北京六一儀器廠提供DYCZ-25D型電泳儀、DYCZ-40G型轉膜儀；由美谷分子儀器有限公司(上海)提供SpectraMaxiD5型多功能酶標儀；由日本Olympus公司提供FV1200型激光共聚焦顯微鏡；由美國Bio-Rad公司提供UniversalHoodⅢ型凝膠圖像成像分析系統。

1.3分組和造模 對大鼠進行為期1 w的適應性飼養，將其隨機分為空白組(10只)及造模組(75只)，選擇復方地芬諾酯進行造模，使用15 mg/(kg·d)復方地芬諾酯進行灌胃，在灌胃1個月后建立慢傳輸型便秘模型〔5〕。大鼠在2 w內出現明顯便秘癥狀。與空白組相比，模型組體重明顯減輕，24 h糞便數量明顯減少，糞便含水量也減少，說明成功復制大鼠模型。剔除造模失敗大鼠，將造模成功的大鼠(50只)進行二次分組，分為模型組、伊托必利組和補腎潤腸方低、中、高劑量組各10只。

1.4給藥 補腎潤腸方劑 藥液制作方法：將藥材置于砂鍋內，加2 000 ml水浸泡30 min，煎煮60 min后取汁200 ml，再次加水、浸泡后煎煮，取汁200 ml，充分混勻2次取得的藥液400 ml，采用減壓濃縮法，將補腎潤腸方液湯濃縮為濃度為2.2 g/ml的藥液，計算出藥量為高劑量組33.2 g/(kg·d)、中劑量組16.6 g/(kg·d)、低劑量組8.8 g/(kg·d)。根據相關文獻記載進行伊托必利藥物劑量選擇〔6〕，根據人和動物體表面積折算方法對大鼠用藥劑量進行換算，確定各組大鼠用藥劑量，即伊托必利組按50 mg/kg劑量灌胃，補腎潤腸方低、中、高劑量組分別按相應劑量灌胃，空白組及模型組進行等體積生理鹽水灌胃，各組灌胃1次/d，持續干預1個月。

1.5標本制備方法 ①結腸組織。在完成干預后統一頸椎脫臼處死大鼠，處死前禁食24 h，將大鼠腹部切開，確定胃底位置，然后由幽門位置將腸管捋出并摘除，摘除范圍為幽門至直腸末端肛管上方，然后根據腸管位置不同分別截取近端及遠端結腸各3 cm，將結腸組織均分為3段，對結腸內污物采用生理鹽水進行清洗，然后再使用磷酸鹽緩沖液(PBS)進一步清洗，隨機選取其中一節腸管使用濃度為10%的多聚甲醛進行固定處理，將剩余兩節腸管放置于冰箱中保存，溫度設置為-80℃。②腦組織。于大鼠枕骨大孔進刀，將顱骨切開后，去除頭頂骨，并將視神經剪斷，取出腦組織，用人工腦脊液對表面血液進行沖洗，并以濾紙將殘留血液吸除。于冰盤上對大腦組織進行剝離，提取前額葉皮質、下丘腦、海馬及紋狀體，放入1.5 ml Eppendorf離心管中，存儲于-80℃冰箱內待檢。

1.6蘇木素-伊紅(HE)染色及免疫組化檢測AQP3、AQP9表達 ①HE染色：脫蠟。于4%多聚甲醛中置入1段結腸，予以固定24 h后，石蠟包埋切片，水化。于二甲苯中予以浸泡15 min，連續2次后，依次以梯度乙醇及純水浸泡，各5 min，連續2次。染色。以蘇木素進行初染，沖洗，伊紅復染，依次以梯度乙醇及純水浸泡，各2 min，再予以二甲苯透明處理2 min后，中性樹膠進行封片，于光鏡鏡頭下進行檢查。②免疫組化：取HE染色的組織塊，4 μm切片，切片按照順序電烤箱1 h，在二甲苯Ⅰ和Ⅱ中浸泡10 min，然后依次放在梯度酒精5 min×2次，隨后用PBS(pH7.4)沖洗2 min×3次，浸入枸櫞酸鹽緩沖液內，20 min后PBS沖洗5 min×3次，在切片上滴加濃度為10%的正常山羊血清封閉液，進行15 min孵育，溫度設置為37℃。滴加一抗(按照1∶100稀釋)，孵育過夜，PBS沖洗3次。滴加二抗(IgG)，PBS沖洗3次，用二氨基聯苯胺(DAB)顯色，鏡下觀察染色程度，將其置入蘇木素溶液中，分化使用鹽酸乙醇，常規進行脫水、透明及封片等處理，然后在鏡下觀察，通過Motic3000顯微鏡觀察。

1.7Western印跡檢測AQP3、AQP9蛋白表達 對蛋白濃度進行調整，相同后添加緩沖液，加熱至100℃，維持沸騰狀態10 min，在制膠架上展開分離膠制作，將電泳緩沖液加入其中，條帶分離達到最佳狀態時即可停止電泳。對轉膜液進行4℃預冷處理，轉膜90 min后，將聚偏氟乙烯膜取出并做標記，以TBST洗膜10 min，連續3次。將封閉液加入至封閉盒內，震蕩60 min，于裝有AQP3、AQP9Ⅰ抗的孵育盒內添加聚偏氟乙烯膜，置于4℃環境中過夜。以TBST洗膜10 min，連續3次，稀釋Ⅱ抗，再以TBST洗膜10 min，連續3次。于暗室對包含蛋白質的聚偏氟乙烯膜進行曝光處理。

1.8高效液相-電化學檢測儀對大鼠腦區神經遞質的含量 于0.5 ml預冷工作內標液中加入待測腦組織，在冰浴條件下以電動微量勻漿器展開快速勻漿，予以靜置10 min后，于4℃環境中予以14 000 r/min×15 min離心，取上清液后以Millipore 0.22 μm針頭式過濾器進行過濾。色譜條件為：①預柱：ESAHR-80，8.0 cm×4.6 cm；②流動相：10%乙腈、1.7 mmol/L1-辛烷磺酸鈉、pH=3、90 mmol/L磷酸二氫鈉、50 μmol/L乙二胺四乙酸、50 mmol/L檸檬酸；③色譜柱：ESAMD-150(3.2 mm×150 mm)；④流速：0.66 ml/min；⑤柱溫：30℃；⑥進樣量：20 μl；⑦電勢：共4道，分別是150、500、200、350 mV。

1.9實時熒光定量PCR檢測結腸細胞AQP3、AQP9 mRNA表達 提取結腸中的mRNA采用Trizol法進行，嚴格參照說明書操作，用核酸蛋白儀對總mRNA提取后的純度進行檢測，純度在1.8～2.0時為合格，進行逆轉錄合成，按照TaKaRa逆轉錄試劑盒操作要求進行，各種試劑添加均嚴格按照SYBRPremixExTaqTM試劑盒說明書進行，基因擴增在PCR儀中完成，反應條件設置為溫度95℃，反應時間為10 min，然后95℃，反應10 s，最后60℃，反應30 s，共進行40個循環，然后溫度95℃，反應15 s，溫度75℃，反應15 s，溫度設置為75℃，反應30 s。對PCR過程中各組樣本中的Ct值進行分析，mRNA相對表達水平采用2-△△Ct表示。光密度值采用酶標儀進行測定，內參β-actin及AQP9、AQP3引物序列為：β-actin：上游：5′-GAAGATCAAGATCATTGCTC CT-3′,下游:5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3′;AQP3:上游:5′-GTTCCGTGGCTCAAGTGGTGCTCAG-3′，下游:5′-GCAGGGTTCAAG TGGGCTCCAGACA-3′;AQP9:上游:5′-TCGGCAGT CGTGATGGCTCTCTATGA-3′，下游:5′-AGGCACCTGGCGTGGATATGAATGGA-3′。

1.10統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析(One-WayANOVA)，方差齊則采用LSD-t檢驗，方差不齊則采用TamhaneT2檢驗。

2 結 果

2.1老年慢傳輸型便秘大鼠AQP3及AQP9光密度表達 AQP3呈現帶狀條形規律分布，主要分布位置為大鼠近端結腸組織黏膜頂部吸收細胞的質膜頂部(腔面)上，陽性染色為棕黃色；AQP9同樣呈現條帶狀規律分布，主要分布在大鼠遠端結腸組織黏膜的杯狀細胞上，染色為棕黃色。與空白組相比，模型組AQP3、AQP9光密度值明顯升高(P<0.05)，與模型組相比，伊托必利組、補腎潤腸方低、中、高劑量組AQP3、AQP9光密度值明顯降低(P<0.05)，與伊托必利組相比，補腎潤腸方低、高劑量組AQP3、AQP9光密度值明顯升高(P<0.05)，而補腎潤腸方中劑量AQP3、AQP9光密度值無明顯差異(P>0.05)，見圖1、表1。

圖1 各組AQP3、AQP9光密度表達(HE染色，×400)

表1 各組AQP3及AQP9光密度比較

2.2各組結腸組織AQP3、AQP9蛋白及mRNA表達 與空白組相比，模型組AQP3、AQP9蛋白及mRNA表達均明顯升高(P<0.05)，與模型組相比，伊托必利組、補腎潤腸方高劑量組AQP3、AQP9蛋白及mRNA表達均明顯降低(P<0.05)，補腎潤腸方低、中劑量組AQP3、AQP9蛋白及mRNA表達均降低，但差異無統計學意義(P>0.05)，與伊托必利組相比，補腎潤腸方低、中劑量組AQP3、AQP9蛋白及mRNA表達均明顯升高(P<0.05)，補腎潤腸方高劑量組AQP3、AQP9蛋白及mRNA表達升高，但差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2、表2。

1～6：空白組，模型組，伊托必利組，補腎潤腸方低劑量組，補腎潤腸方中劑量組，補腎潤腸方高劑量組圖2 各組結腸組織AQP3、AQP9蛋白表達

表2 各組結腸組織中AQP3、AQP9蛋白及mRNA表達

2.3各組腦區神經遞質含量比較 與空白組相比，模型組皮質、下丘腦、海馬甲腎上腺素(NE)水平明顯升高，多巴胺(DA)及5-羥色胺(HT)水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較,伊托必利組及補腎潤腸方各組皮質、下丘腦、海馬中NE水平明顯降低，DA及5-HT水平明顯升高(P<0.05)；與伊托必利組相比，補腎潤腸方各組皮質、下丘腦、海馬中NE水平降低，DA及5-HT水平升高，但差異無統計學意義(P>0.05)，補腎潤腸方各組各指標差異無統計學意義(P>0.05),見表3。

表3 各組腦區神經遞質含量比較

3 討 論

慢傳輸型便秘是老年人常見病，中醫學將慢傳輸型便秘歸于“便悶”范疇，《素問·靈蘭秘典論篇》有“大腸者，傳導之官，變化出焉”的觀點，強調大腸的功能是對小腸、脾胃消化吸收后的糟粕進行傳導，大腸傳導功能正常，糞便能夠正常排出；大腸傳導功能異常，糞便則無法排出，引起便秘〔7〕。中醫治療慢傳輸型便秘的重點在于“通下”，補腎潤腸為主要措施之一，方中山茱萸及熟地黃滋腎陰，而肉蓯蓉暖腰潤腸，具補腎陽之效，三者共作君藥，可雙補陰陽；白術補氣健脾，可促大腸運化；何首烏及當歸均補血潤腸；枳殼及萊菔子能寬腸下氣助通便；牛膝補腎壯腰；杏仁降肺氣及滋腸燥；瓜蔞仁及火麻仁均潤腸通便〔8〕。諸藥合用，共奏潤腸通便及補腎益精之效。

本研究提示補腎潤腸方組的干預效果雖未達到健康水平，但各項指標均與伊托必利組相似，表明補腎潤腸方能使老年慢傳輸型便秘大鼠AQP3、AQP9表達降低。AQP3為胃腸神經遞質，在消化系統中大量分布，于大腸、胃部及小腸中均有表達，其含量出現異常是引起便秘及腹瀉的重要因素之一〔9〕。到目前為止，在腸道內已發現存在十多種AQPs表達，其中AQP1、AQP3、AQP4、AQP8、AQP9最為常見，目前已有研究指出，AQP3在結腸組織中存在高表達時，腸道內水分明顯減少，而出現AQP3低表達時，腸道內水分增加〔10〕。研究指出，在進行細胞染色時發現，其染色部位主要集中在杯狀細胞的基底側，在便秘患者中，存在AQP9低表達情況，分析其水平下降與患者便秘癥狀存在相關性〔11〕。結腸中AQP3及AQP9含量升高與大鼠糞便含水量呈負相關，即大鼠結腸內AQP3及AQP9含量升高，致使腸道平滑肌出現痙攣，腸道的吸水能力增強，影響腸道蠕動頻率，導致便秘出現。補腎潤腸方具有潤腸通便及補腎益精的功效，通過對老年慢傳輸型便秘大鼠進行干預，使其腸道的平滑肌張力得到有效控制，降低結腸中糞便的推進阻力，改善便秘程度，促進大鼠順利排便，使AQP3、AQP9表達降低〔12〕。

研究發現，內分泌異常、腦-腸軸紊亂、心理應激、腸道動力異常及免疫功能異常等均可能引起便秘，且各種發病機制相互作用，于腦-腸軸內，胃腸道效應細胞、中樞神經系統、自主神經系統間產生神經傳遞作用的物質即腦腸肽，而慢傳輸型便秘出現后，患者血液、腸黏膜中腦腸肽含量發生改變，呈現出失衡狀態〔13〕。胃腸道功能處于應激狀態時，NE與5-HT均會活化，并于機體活動調節中處于對立統一關系，其中NE能使中樞系統興奮，而5-HT能對中樞系統產生抑制作用。DA為NE前體，同時又是獨立神經遞質，于腦-腸軸內可對胃腸功能產生調節作用〔14〕。本研究結果提示，補腎潤腸方可對老年慢傳輸型便秘大鼠中樞神經遞質及胃腸激素的腦-腸軸產生調控作用，原因可能是通過發揮補腎潤腸方潤腸通便及補腎益精的功效，在改善患者腸道功能的同時，促使患者中樞神經系統功能恢復，并且調節中樞單胺類神經遞質，從而促使神經遞質改善。

綜上，補腎潤腸方可降低老年慢傳輸型便秘大鼠AQP3、AQP9表達，并對中樞神經遞質及胃腸激素的腦-腸軸產生調控作用。但由于生物體內在機制十分復雜，且實驗設計還存在一定缺陷，可能使本研究結果受到影響。對此，后續需加大研究樣本量，并且展開重復實驗。