硫化氫通過抑制TGF-β1/Smad2信號通路改善代謝綜合征大鼠的心肌纖維化

鄭霞 譚文婷 易嘉莉 李亞靈 劉達 王森 宋熊 張晶晶 褚春 楊軍

(南華大學 1附屬第一醫院心血管內科，湖南 衡陽 421000；2附屬第二醫院藥劑科)

代謝綜合征(MS)是指機體的碳水化合物、脂肪及蛋白質等物質發生代謝異常并集中出現的一種臨床癥候群，是多種心血管疾病發生與發展的重要危險因素〔1〕。MS人群的心血管疾病發生率呈逐年上升趨勢〔2〕，而且其可導致負性心室重構，最終引起心力衰竭。MS可能與炎癥反應、氧化應激、細胞自噬、內質網應激有關〔3，4〕，但其內在調控機制仍不是十分清楚。轉化生長因子(TGF)-β1/Smad2通路不但參與了MS的發病過程，而且與心肌纖維化的發生及發展密切關聯〔5〕。硫化氫(H2S)是近些年來發現的內源性氣體信號分子，已被證實在體內具有廣泛的生物學效應，研究顯示其具有抗內質網應激、抗凋亡、抗炎、抗纖維化等多種生物學效應〔6〕。本課題組前期發現，H2S可以通過不同的機制減輕多種不同心血管疾病大鼠的心肌纖維化，而H2S是否可以減輕MS大鼠的心肌纖維化及具體作用機制目前尚不明確，因此本研究以高糖高脂飲食誘使大鼠發生心肌纖維化，同時予以H2S干預，觀察H2S對MS大鼠心肌纖維化的影響及內在的調控機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 體重(150±20)g的40只健康成年雄性SD大鼠，由長沙斯萊克動物實驗中心提供，在溫度(24±3)℃、通風度和濕度適宜的實驗室內單籠喂養，采用人工照明，設定光照周期為12 h。大鼠均自由攝食和飲水。

1.2實驗主要試劑 硫氫化鈉 (NaHS)購于Sigma公司；彩色預染Marker購于Fermentas公司；TGF-β1、Smad2、甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)兔抗大鼠一抗及抗兔二抗均購自Proteintech公司。

1.3分組及模型的建立 40只雄性SD大鼠放于適宜的環境中適應性喂養7 d，然后分成：正常組、MS組、MS+H2S組、H2S組，每組10只大鼠，MS組及MS+H2S組采取高糖高脂飲食的方式造模〔7〕，其余兩組喂養同等量的普通飼料。按查閱文獻中的指標確定建模成功后〔8〕，MS+H2S組和H2S組予以NaHS〔56 μmol/(kg·d)，用生理鹽水稀釋〕腹內注射6 w，另兩組則以同等量的生理鹽水腹內注射，6 w后，稱量所有大鼠的體重后將其麻醉處死，留取心臟標本，用于后期檢驗。

1.4血清生化指標及尾動脈血壓檢測 各組大鼠予以不同的飼料喂養6 w后，以測量3次有效的尾動脈收縮壓平均值為大鼠的血壓；禁食后抽取空腹血，以血糖檢測儀(試紙法)測取空腹血糖；采1.5～2.0 ml的尾靜脈血，三酰甘油以甘油磷酸氧化酶法測定，膽固醇以酶比色法測取。

1.5Masson染色分析纖維化程度 取甲醛固定的大鼠心肌組織，以石蠟包埋，制作厚約4 μm的切片，常規脫蠟至水，以不同濃度的乙醇進行脫水處理后，以Masson試劑盒染色，并以梯度酒精脫水，最后樹膠封片，在光學顯微鏡下進行觀察。

1.6Western印跡觀察心肌組織中TGF-β1、Smad2蛋白的表達 取各組大鼠的部分心肌組織，充分研磨后提取組織蛋白，然后對照二喹啉甲酸(BCA)試劑盒說明書有步驟的完成蛋白定量，并嚴格遵照Western印跡的具體步驟，常規電泳、轉膜和封閉，并以TGF-β1、Smad2等兔抗大鼠一抗及抗兔二抗孵育，電化學發光(ECL)顯影照相，留取條帶圖。最后對所得的目的條帶進行分析。

1.7統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行LSD-t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1大鼠體重、血糖和血脂情況比較 與正常組比較，MS組和MS+H2S組體重、血壓、三酰甘油及總膽固醇水平明顯上升(P<0.05)，而以上所測的指標在MS組和MS+H2S組之間則無明顯差別(P>0.05)。見表1。

表1 各組體重、血壓、三酰甘油、總膽固醇及TGF-β1蛋白、Smad2蛋白、膠原纖維沉積

2.2各組心肌組織Masson染色對比分析 與正常組比較，MS組的心肌細胞排列不規則，鏡下可見到較多藍染的纖維，而與MS組對比，MS+H2S組鏡下可見膠原沉積情況顯著改善(P<0.05)。H2S組與正常組大鼠心肌組織的膠原纖維沉積無顯著差異(P>0.05)。見表1、圖1。

深藍色條狀物即為被染色的膠原纖維，紅染的為肌纖維圖1 H2S對大鼠心肌纖維化沉積的影響(Masson染色，×400)

2.3各組心肌組織TGF-β1蛋白的表達情況 與正常組比較，MS組心肌組織中TGF-β1的表達水平顯著上調(P<0.05)；與MS組相比，H2S+MS組心肌組織中TGF-β1的表達顯著下調(P<0.05)。而H2S組與正常組大鼠心肌組織TGF-β1的表達對比無明顯區別(P>0.05)。見表1、圖2。

2.4各組心肌組織中Smad2的表達 與正常組比較，MS組心肌組織中Smad2的表達水平顯著上調(P<0.05)；而與MS組對比，H2S+MS組心肌組織中Smad2蛋白的表達水平顯著下調(P<0.05)。而H2S組與正常組心肌組織Smad2蛋白的表達水平對比無明顯區別(P>0.05)。見表1、圖2。

圖2 各組心肌組織中TGF-β1、Smad2蛋白的表達水平

3 討 論

隨著久坐、高能量飲食等生活習慣的變化及肥胖人群的增多，MS目前已經變成了一種日益嚴峻的全球性健康問題，其主要以胰島素抵抗、中心型/腹型肥胖、血糖及血脂異常等多種物質在體內代謝紊亂為臨床表現，并可促進多種心血管疾病的發生與發展〔9，10〕。有研究發現，MS可直接導致心肌損傷和負性心室重構，增加心血管疾病發生率，最終可致使心臟舒張功能障礙，甚至是心力衰竭〔11〕。本研究通過高糖高脂飲食喂養的方式構建MS模型成功后，Masson染色顯示MS組大鼠的心肌細胞排列無序，細胞間可見大量藍染的纖維，提示MS組大鼠的心肌存在明顯的纖維化。

有研究顯示，氧化應激、炎癥反應、自噬等參與了MS心肌纖維化的發生，但其中的具體調控機制尚不十分明確〔12，13〕。TGF-β是重要的致纖維化細胞因子，在成纖維細胞的調節、增殖、遷移及轉分化中發揮了重要的作用，往往在機體各臟器發生纖維化時不可或缺。目前發現在哺乳動物中主要存在有TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3這三種形式，而在TGF-β信號通路中，Smads是一種關鍵的傳導分子，其作為最初被證實的TGF-β受體激酶底物，主要作用是將從TGF-β接收的信號直接由細胞膜傳入到細胞核內。TGF-β被激活后可活化胞質內的Smads，從而進入核內并調控轉錄。已有諸多學者發現，TGF-β1/Smad2通路參與了多種心血管疾病的發生和發展過程〔14〕。在心肌梗死過程中，TGF-β1活化后可作用于Smad2/3，使其發生磷酸化并進入細胞核，可以誘導肌成纖維細胞(MFB)向促纖維化的MFB表型分化，最終導致心肌纖維化〔15〕。本研究提示TGF-β1/Smad2通路可能參與了MS心肌纖維化發生和發展的調控機制。

H2S是一種在一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)后出現的內源性氣體信號分子，已有相關報道表示，在一定濃度下對心、腦、腎等機體重要器官具有一定的保護作用，而其發揮心臟保護作用的機制主要涉及促進自噬、抑制氧化應激、抑制炎癥、改善代謝等〔16，17〕。已發現H2S可以下調P38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)及TGF-β1改善糖尿病小鼠的心肌纖維化〔18〕。本研究結果提示，當使用外源性H2S后，MS大鼠的心肌纖維化得到了非常明顯的改善，而TGF-β1/Smad2相關蛋白的表達水平也顯著下調，表明H2S干預后可減輕MS大鼠的心肌纖維化，其可能與抑制TGF-β1/Smad2信號通路有關。綜上所述，內源性H2S可能通過TGF-β1/Smad2通路參與了MS心肌纖維化發生的調控機制，而外源性H2S供體藥物可能在改善MS心肌纖維化具有重要的應用前景，而其內在調控機制仍有待進一步研究。