miR-493-5p靶向HOPX基因對前列腺癌細胞增殖、凋亡的影響及機制

孫繼建 潘世杰 趙俊峰 (河南省中醫院泌尿外科，河南 鄭州 450000)

前列腺癌是泌尿生殖系統惡性腫瘤，目前有根治性手術治療、放化療、內分泌治療等治療手段〔1〕。由于內分泌治療、放療及細胞毒性藥物治療對晚期前列腺癌的療效有限，因此研究新型治療藥物具有重要的臨床意義；隨著分子生物學的發展，分子靶向治療成為新的治療方法〔2〕。miRNA可以調控多種生物學過程，并調節細胞和基因表達，研究發現miRNA能通過調控多種信號通路調控前列腺癌的發生與發展，了解它們之間的關系，有助于從分子生物學角度認識前列腺癌的發病機制，指導臨床治療及預后〔3〕。miR-493能有效抑制乳腺癌MCF7細胞的增殖、遷移、浸潤和腫瘤形成的能力〔4〕。miR-493-5p在前列腺癌中下調表達，過表達miR-493-5p可抑制前列腺癌細胞增殖、遷移侵襲〔5〕。同源域特有蛋白(HOP)X是非HOX基因家族成員，被認為是一種抑癌基因，其在小鼠心肌細胞中下調表達，會引起心臟肥大和心力衰竭〔6〕。HOPX蛋白在非小細胞肺癌組織中低表達，與TNM分期有關〔7〕。HOPX能抑制肺癌細胞系HCC827凋亡、促進細胞分裂增殖〔8〕。但HOPX對前列腺癌細胞的增殖、凋亡的影響尚未清楚，本文研究miR-493-5p是否通過HOPX影響前列腺癌細胞的增殖、凋亡。

1 材料與方法

1.1材料 正常膀胱上皮細胞HUC和前列腺癌細胞T24、5637、SW780均購自中國科學院上海細胞庫；RPMI1640培養基購自美國Gibco公司；Trizol試劑、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；CCK-8試劑盒、凋亡檢測試劑盒、放射免疫沉淀試驗(RIPA)蛋白裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養與分組 正常膀胱上皮細胞HUC和前列腺癌細胞T24、5637、SW780用RPMI1640培養基常規培養；取對數生長期細胞T24，將miR-con、miR-493-5p、si-con、si-HOPX分別轉染至T24細胞，記為miR-con組、miR-493-5p組、si-con組、si-HOPX組；將miR-493-5p分別與pcDNA和pcDNA-HOPX共同轉染至T24細胞，記為miR-493-5p+pcDNA組、miR-493-5p+pcDNA-HOPX組，正常培養的T24細胞作為NC組。

1.2.2qRT-聚合酶鏈反應(PCR)檢測miR-493-5p和HOPX mRNA表達水平 提取所有細胞總RNA，反轉錄成cDNA，按照TaKaRa 熒光定量試劑盒說明進行PCR擴增，相對表達量采用2-△△Ct法計算。

1.2.3Western印跡檢測蛋白表達 提取各組細胞總蛋白，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜后進行封閉，然后分別加入HOPX、細胞周期蛋白(Cyclin)D1、酶切半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3、β-actin一抗(1∶800)，4℃孵育過夜；加入二抗(1∶1 000)室溫孵育2 h，顯影，定影，分析蛋白條帶吸光度值。

1.2.4四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法檢測細胞活性 各組細胞培養24、48、72 h時，分別加入20 μl MTT溶液，孵育4 h；加入150 μl二甲基亞砜，振蕩反應10 min，酶標儀檢測490 nm處吸光度(OD)值。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡率 離心收集各組細胞，漂洗后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育15 min；上流式細胞儀檢測。

1.2.6雙熒光素酶報告實驗 構建HOPX野生型和突變型熒光素酶表達載體(WT-HOPX和MUT-HOPX)，將其分別與miR-con或miR-493-5p轉染至T24細胞中，按說明書操作檢測細胞熒光素酶活性。將miR-con、miR-493-5p、anti-miR-con、anti-miR-493-5p轉染至T24細胞中，Western印跡檢測HOPX蛋白表達。

1.3統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1前列腺癌細胞株中miR-493-5p 和HOPX的表達 與正常膀胱上皮細胞HUC相比，前列腺癌細胞T24、5637、SW780中miR-493-5p表達水平均降低，差異有統計學意義(P<0.05)，HOPX mRNA和蛋白表達水平均升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 Western印跡檢測各細胞HOPX的表達

表1 各細胞中miR-493-5p 和HOPX的表達

2.2miR-493-5p過表達對前列腺癌細胞T24增殖和凋亡的影響 與NC組及miR-con組相比，miR-493-5p組miR-493-5p表達水平顯著升高，酶切Caspase-3表達水平顯著升高，CyclinD1表達水平顯著降低，培養48、72 h的細胞活性顯著降低，T24細胞凋亡率顯著升高(均P<0.05)。見圖2，圖3，表2。

圖2 Western印跡檢測各組CyclinD1、酶切Caspase-3的表達

圖3 檢測前列腺癌細胞T24凋亡率

表2 下調miR-493-5p 表達對前列腺癌細胞T24增殖和凋亡的影響

2.3miR-493-5p靶向調控HOPX的表達的影響 TargetScan預測顯示HOPX與miR-493-5p有結合位點，見圖4。miR-493-5p與WT-HOPX共轉染后T24細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；miR-493-5p與MUT-HOPX共轉染后T24細胞熒光素酶活性差異不顯著(P>0.05)。見表3。miR-493-5p組HOPX蛋白表達水平(0.39±0.03)顯著低于miR-con組(1.00±0.08，P<0.05)；anti-miR-493-5p組HOPX 蛋白表達水平(1.49±0.09)顯著高于anti-miR-con組(0.83±0.05，P<0.05)。見圖5。

圖4 miR-493-5p 與HOPX存在的互補核苷酸序列

表3 雙熒光素酶報告實驗

1～4：miR-con組、miR-493-5p組、anti-miR-con組、anti-miR-493-5p組圖5 Western印跡檢測各組HOPX的表達

2.4干擾HOPX對前列腺癌細胞T24的抑制作用 與NC組及si-con組相比，si-HOPX組酶切Caspase-3表達水平顯著升高，CyclinD1、HOPX表達水平顯著降低，48、72 h時細胞活性顯著降低，T24細胞凋亡率顯著升高(均P<0.05)。見圖6，表4。

圖6 Western印跡檢測前列腺癌細胞HOPX、CyclinD1和酶切Caspase-3的表達

表4 干擾HOPX抑制前列腺癌細胞T24 增殖和誘導凋亡的作用

2.5過表達HOPX部分逆轉miR-493-5p對前列腺癌細胞T24的抑制作用 與miR-493-5p+pcDNA組相比，miR-493-5p+pcDNA-HOPX組酶切Caspase-3表達水平顯著降低，CyclinD1、HOPX表達水平顯著升高，48、72 h時細胞活性顯著升高，T24細胞凋亡率顯著降低(均P<0.05)。見表5，圖7。

表5 過表達HOPX部分逆轉沉默miR-493-5p抑制前列腺癌細胞T24 增殖和誘導凋亡的作用

1～2：miR-493-5p+pcDNA組、miR-493-5p+pcDNA-HOPX組圖7 Western印跡檢測前列腺癌細胞HOPX、CyclinD1和酶切Caspase-3的表達

3 討 論

前列腺癌發病率逐年上升，有較高的惡性傾向，嚴重危害男性健康。尋找高特異度、高敏感度的前列腺癌診斷標志物有利于早期診斷與有效治療〔9〕。miRNA參與調節許多重要的細胞生物學行為，多種miRNA在前列腺癌中異常表達，與前列腺癌的發生、發展密切相關〔10〕。miR-493在前列腺癌中上調表達，miR-493通過靶向PHLPP2并激活Akt信號通路促進前列腺癌細胞的增殖〔11〕；miR-493-5p通過前列腺癌中的AKT/GSK-3β/Snail信號傳導抑制上皮間質轉化(EMT)，在前列腺癌細胞中起腫瘤抑制劑的作用〔12〕。miR-493-5p可減弱人乳腺癌細胞的侵襲性〔13〕；miR-493-5p可抑制肝癌細胞的增殖和侵襲〔14〕。過表達miR-493-5p通過下調KLF5和使PI3K/AKT信號傳導途徑失活來抑制骨肉瘤細胞的增殖和轉移〔15〕。本實驗結果表明，在前列腺癌細胞中miR-493-5p顯著低表達，過表達miR-493-5p可抑制T24細胞增殖，并促進其凋亡。

HOPX多在人類癌癥表觀遺傳沉默，被認為是腫瘤抑制基因，其啟動子甲基化是下調的主要機制；HOPX的表觀遺傳沉默有加速乳腺癌的侵襲〔16〕，還會促進結腸直腸癌的進展〔17〕。腦膠質瘤患者中HOPX基因甲基化率較高，可能與腦膠質瘤的發生相關〔18〕；較高的HOPX表達與不同的臨床和生物學特征相關，并預測新發急性髓細胞白血病的預后不良〔19〕。HOPX在肺癌細胞中通過致癌Ras誘導的細胞衰老發揮腫瘤抑制活性〔20〕。miR-421通過靶向HOPX和調節Wnt/β-連環蛋白信號通路促進非小細胞肺癌的進展〔21〕。本實驗結果表明，前列腺癌細胞中HOPX高表達，干擾HOPX可抑制T24細胞增殖，促進細胞凋亡。且miR-493-5p靶向調控HOPX，過表達HOPX能逆轉miR-493-5p對T24細胞增殖和凋亡的作用。