Nrf2/HO-1信號通路在帕潘立酮治療精神分裂癥大鼠中的作用

王莉 張凇 龍威 (齊齊哈爾醫學院精神衛生專業，黑龍江 齊齊哈爾 161003)

精神分裂癥(SZ)臨床癥狀主要表現為思維、情感和行為等方面障礙，SZ發病率和致殘率非常高〔1〕，目前，SZ確切的發病機制還不清楚。地卓西平馬來酸鹽(MK-801)為非競爭性N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑，通過拮抗NMDA受體模擬SZ陽性與陰性癥狀〔2〕。研究表明采用MK-801可使自發性活動增加、社會交往、感覺運動及學習記憶功能等缺陷發生〔3,4〕。抗精神病藥物能逆轉MK-801誘導的上述異常行為〔5,6〕。帕潘立酮是新型非典型的抗精神病類藥物，用于急慢性SZ治療，有效降低SZ復發率，不良反應少〔7,8〕。目前，帕潘立酮抗SZ及神經元保護機制尚不明確。轉錄因子NF-E2相關因子(Nrf)2是十分重要的核轉錄因子，被激活時能進入細胞核，結合抗氧化反應元件，啟動抗氧化物的轉錄以對抗氧化應激損傷〔9〕。血紅素氧合酶(HO)-1是Nrf2重要的下游靶分子，催化血紅素降解成為膽綠素、一氧化碳(CO)和鐵等酶解產物，并發揮較強抗氧化、抗炎作用〔10〕。本研究通過探討帕潘立酮治療MK-801誘導的SZ小鼠療效及Nrf2/HO-1信號通路的參與作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級，50只健康SD大鼠，體重180～220 g，購自浙江省實驗動物中心，許可證號：SCXK(浙)20080033。適應性飼養7 d后，開展實驗，所有動物在實驗過程中自由飲食。

1.1.2藥物與主要試劑 MK-801、利培酮、帕潘立酮(Sigma)；MK-801溶于生理鹽水中，配成濃度為2 mg/ml，置于-70℃中保存備用。將帕潘立酮溶解于1 μl/ml的冰乙酸雙蒸水中，使用1 mol/L氫氧化鈉(NaOH)溶液(索萊寶)將其pH調至6.0，分別配成濃度為0.03、0.30 mg/ml的溶液，現用現配；一抗：酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2相關X蛋白(Bax)、Nrf2、HO-1、二抗(美國Abcam)。

1.2方法

1.2.1動物分組及模型構建 將50只SD大鼠飼養于室溫條件下，不限制其進食、飲水，適應性喂養2～3 d后采用MK-801進行誘導構建SZ小鼠模型〔11〕。將其隨機分成5組：對照組(Control組)、SZ組(Model組)、利培酮組、低劑量帕潘立酮組和高劑量帕潘立酮組，每組8只，其余10只用于補充其他各組死亡的大鼠。Control組及Model組給予等量的生理鹽水，低劑量帕潘立酮組、高劑量帕潘立酮組和利培酮組的大鼠分別給予帕潘立酮(0.03 mg/kg，1次/d)、帕潘立酮(0.30 mg/kg，1次/d)和利培酮(0.10 mg/kg，1次/d)，采用灌胃進行治療。2次/d，持續給藥15 d后對大鼠進行行為學測試。

1.2.2自發活動 采用43.2 cm×43.2 cm×30.5 cm 規格的有機玻璃曠場試驗測試箱對大鼠進行分析，并在試驗箱周圍配備紅外線網絡跟蹤監測系統〔12〕。暗光線、安靜的房間內進行本實驗，該測試系統記錄大鼠10 min內的自由活動情況及位置信息，并采用數據采集和分析處理系統模擬大鼠整個活動軌跡，并分析大鼠總活動距離。實驗結束后，使用70%的酒精清洗實驗箱，晾干。

1.2.3水迷宮實驗 水迷宮實驗測試大鼠參考記憶，其主要由圓形水池(半徑為60 cm)和平臺組成，其水深30 cm，將水迷宮池等分為4個象限區域，分別記為NE、SE、SW、NW，平臺直徑為6 m，高14 cm。將水溫保持在(23±1)℃，在整個實驗過程中，迷宮周圍一切標志保持不變〔13〕。正式實驗開始之前，將大鼠放入水迷宮中，熟悉約1 min，開始正式訓練，將大鼠以面向池壁的方式隨機從4個入水點放入水中，記錄大鼠從入水到水下平臺的時間，即逃避潛伏期；4次/d，間隔30 min，連續4 d進行訓練，從第5天開始測試并記錄大鼠逃避潛伏期；之后撤除水下平臺，進行空間探索實驗并記錄大鼠1 min內穿越平臺的總次數。

1.2.4社會交往 采用有機玻璃材質的社會交往測試箱對大鼠社會交往進行測試，實驗開始前，將大鼠進行2 d隔離，每天在社會交往測試箱中適應約10 min，第3天將大鼠進行兩兩配對，每對體重差≤20 g，將配對后的大鼠放入箱中測試15 min，用相機記錄并分析〔14〕。評價指標為社會交往時間與非攻擊性行為百分比，非攻擊性行為百分比=〔非攻擊性行為時間/(非攻擊性行為時間+攻擊性行為時間)×100%〕。

1.2.5Western印跡檢測大鼠海馬組織中酶切caspase-3、Bax、Nrf2和HO-1蛋白表達水平 將大鼠海馬組織置于冰水浴中進行勻漿，根據總蛋白提取試劑盒說明書對大鼠海馬組織中的總蛋白進行提取，之后采用二喹啉甲酸(BCA)法對蛋白濃度進行測定。將各組50 μg的蛋白樣品進行上樣，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，之后轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。再采用5%的脫脂牛奶封閉2 h。然后，分別加入一抗酶切caspase-3(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、Nrf2(1∶600)、HO-1(1∶500)在4℃下過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2～3次，之后與二抗進行孵育，室溫反應1 h，之后在避光條件下采用TPBS進行洗膜，以β-actin作為參照，最后使用凝膠成像系統分析條帶的相對密度值，并通過酶切caspase-3、Bax、Nrf2、HO-1與β-actin的比值表示其表達水平。

1.3統計學方法 采用SPSS26.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1帕潘立酮對SZ大鼠自發活動的影響 與Control組自發活動總距離〔(24 981.62±4 052.83)cm〕相比，Model組〔(98 345.60±9 036.25)cm〕顯著升高(P<0.05)；與Model組自發活動總距離相比，利培酮組、低劑量帕潘立酮組、高劑量帕潘立酮組〔(40 713.05±3 814.57)、(77 349.56±3 964.58)、(47 453.56±9 823.52)cm〕均顯著降低(P<0.05)；與利培酮組相比，低、高劑量帕潘立酮組自發活動總距離顯著升高(P<0.05)。表明帕潘立酮可減少SZ大鼠總活動距離。

2.2帕潘立酮對SZ大鼠學習記憶的影響 與Control組相比，Model組逃避潛伏期顯著升高，穿越平臺次數顯著減少(P<0.05)；與Model組相比，利培酮組、低劑量帕潘立酮組與高劑量帕潘立酮組逃避潛伏期顯著降低，穿越平臺次數顯著增多(P<0.05)；與利培酮組相比，低、高劑量帕潘立酮組逃避潛伏期均顯著升高，穿越平臺次數均顯著減少(P<0.05)。見表1。表明帕潘立酮能提高逃避潛伏期，降低穿越平臺次數。

表1 不同處理大鼠水迷宮成績比較

2.3帕潘立酮對SZ大鼠社會交往能力的影響 與Control組相比，Model組大鼠社會交往時間和非攻擊性行為百分比均顯著降低(P<0.05)；與Model組相比，利培酮組、低劑量帕潘立酮組、高劑量帕潘立酮組社會交往時間和非攻擊性行為百分比均顯著升高(P<0.05)；與低劑量帕潘立酮組相比，高劑量帕潘立酮組社會交往時間和非攻擊性行為百分比均顯著升高(P<0.05)。見表2。表明帕潘立酮可提高SZ大鼠的社會交往時間和非攻擊性行為百分比。

表2 不同處理大鼠社會交往能力的比較

2.4帕潘立酮對SZ大鼠海馬組織中細胞凋亡相關蛋白表達的影響 與Control組相比，Model組海馬組織中酶切caspase-3和Bax蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；與Model組相比，利培酮組、低劑量帕潘立酮組、高劑量帕潘立酮組酶切caspase-3和Bax蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)；與低劑量帕潘立酮組相比，高劑量帕潘立酮組caspase-3和Bax蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖1、表3。表明帕潘立酮可抑制海馬組織酶切caspase-3和Bax蛋白的表達。

1～5：Control組，Model組，利培酮組，低劑量帕潘立酮組,高劑量帕潘立酮組，下圖同圖1 各組大鼠海馬組織酶切caspase-3和Bax的比較

表3 各組大鼠海馬組織酶切caspase-3、Bax、Nrf2和HO-1蛋白表達水平

2.5帕潘立酮對SZ大鼠海馬組織中Nrf2、HO-1蛋白表達的影響 與Control組相比，Model組海馬組織中Nrf2和HO-1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與Model組相比，利培酮組、低劑量帕潘立酮組、高劑量帕潘立酮組Nrf2和HO-1蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)；與低劑量帕潘立酮組相比，高劑量帕潘立酮組Nrf2和HO-1顯著升高(P<0.05)。見表3、圖2。表明帕潘立酮可通過調控Nrf2/HO-1通路治療大鼠SZ。

圖2 各組Nrf2、HO-1蛋白表達的比較

3 討 論

SZ已經嚴重威脅到人類的生命健康，其發病率呈現逐年上升趨勢〔10〕。研究表明MK-801可誘導SZ樣行為學改變〔11〕，研究表明抗精神病類藥物能夠逆轉MK-801所誘導的大鼠自發性活動〔12〕。本研究結果表明通過帕潘立酮治療可逆轉SZ大鼠自發活動，對SZ模型大鼠有一定治療效果。

SZ主要表現為認知缺陷，注射小劑量MK-801會損害大鼠記憶，說明MK-801誘導的SZ模型鼠模擬SZ患者的認知功能缺陷〔15〕。研究報道腹腔注射小劑量的MK-801可導致成年后大鼠空間學習記憶能力受損〔16〕。與上述研究結果一致，本研究結果表明MK-801誘導的SZ模型鼠空間學習記憶功能受損；帕潘立酮對MK-801所誘導的SZ模型大鼠的空間學習記憶損害有一定逆轉作用，且逆轉效應與治療劑量相關。

研究表明，NMDA能誘導成年大鼠的社交性功能缺陷〔15〕。本研究結果表明經MK-801誘導可導致成年大鼠社交性功能缺陷。研究表明，帕潘立酮可改善SZ患者的社會功能缺陷〔17〕。本研究結果表明帕潘立酮能改善經MK-801所誘導的SZ大鼠社交性功能缺陷，其治療作用與給藥劑量呈現一定相關性。

Nrf2是一種重要的抗氧化轉錄因子，當機體受到不利條件刺激時，在細胞質中，Nrf2從Keap-1中解離，活化后進入核內，對抗氧化反應元件進行識別，啟動下游HO-1及超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化基因的轉錄〔18〕。在體內，HO-1有抗氧化與細胞保護作用，激活Nrf2能起到神經保護作用〔19〕，在轉基因動物腦內，Nrf2通路表達降低〔11〕。在淀粉樣前體蛋白(APP)/早老素基因(PS)1轉基因鼠體內敲除Nrf2基因可使大鼠認知損害顯著增加〔18〕。本研究結果表明上述通路蛋白在帕潘立酮治療SZ大鼠癥狀過程中具有一定的調節作用。