黃芩苷鎂鹽對CCl4誘導SD大鼠急性肝損傷保護機制

王朔 李衛 白冰 黃群 薛潤國 邢恩鴻 郭亞春 宋鴻儒

(1承德醫學院，河北 承德 067000；2承德監獄醫院；3承德市第一中心醫院；4承德醫學院附屬醫院；5河北北方學院)

急性肝損傷極有可能最終發展為肝衰竭。急性肝衰竭病勢急、并發癥多、難治愈、預后差。目前針對急性肝損傷的有效治療方法十分有限，尋找開發新的治療藥物及治療措施，深入研究和探討急性肝損傷的發病機制意義重大。本實驗采用四氯化碳(CCl4)制備大鼠急性肝損傷模型。CCl4 有肝臟毒性且導致急性肝損傷的機制復雜，研究表明與氧化應激有關〔1〕。氧化應激是由于機體受到活性氧(ROS)等其他有害刺激后體內活性氧自由基異常，引起機體過氧化損傷，進而激活了抗氧化損傷防御機制，來維系機體氧化還原的平衡。生理自穩狀態下核轉錄因子(NF)-E2相關因子(Nrf)2 表達水平較低；當機體受到氧刺激后，Nrf2活化入核與抗氧化反應元件(ARE)結合并啟動下游由ARE調控的一系列蛋白基因的表達，進而引發抗氧化應激損傷的作用〔2〕。黃芩苷能抗氧化，在一定程度上能保護大鼠免受CCl4造成急性肝損傷〔3〕，但其水溶性差，黃芩苷鎂鹽吸收更好,且前期實驗已證明黃芩苷鎂鹽對CCl4誘導的SD大鼠急性肝損傷有保護作用〔4〕。本研究繼續采用CCl4誘導的急性肝損傷大鼠為研究對象，通過檢測Nrf2/ARE信號通路中相關蛋白的變化來探討黃芩苷鎂鹽對CCl4誘導急性肝損傷大鼠保護作用機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物 50只SPF級雄性SD大鼠，150～170 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0011。先將所有大鼠在SPF級屏障動物室適應性飼養1 w，自由飲水，室內溫度18～22℃，保持室內濕度50%～60%，每日光照12 h。

1.2實驗儀器與試劑 -80℃低溫冰箱(美國Thermo公司)；磁力攪拌器(中國江蘇波西瓦爾公司)；MyCycler Thermal Cycler(美國BIO-RAD公司)；低溫高速離心機(丹麥Labogene公司)；LightCycler? 96(瑞士Roche公司)；GelDoc凝膠成像儀(美國BIO-RAD公司)；化學發光圖像分析系統(中國上海Tanon 公司)。凍存樣本核蛋白提取試劑盒(河北貝博實驗用品有限公司)；CCl4(國藥集團化學試劑有限公司)；異甘草酸鎂注射液(正大天晴藥業集團股份有限公司)；注射用還原型谷胱甘肽(上海復旦復華藥業有限公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(美國Thermo公司)；醌氧化還原酶(NQO)1 antibody(美國CST公司)；LaminB1 antibody、BeyoECL Star(中國碧云天公司)；anti-Nrf2 antibody、anti-Heme Oxygenase 1 antibody(英國Abcam公司)；PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser 試劑盒、引物、SYBY Premix Ex Taq TM Ⅱ試劑盒(中國大連寶生物公司)；黃芩苷鎂鹽(我校劉翠哲教授課題組提供，其純度為93.1%。)。

1.3方法

1.3.1實驗動物分組與造模 雄性SD大鼠50只，體重150～170 g，隨機分為5組：空白對照組、模型組、異甘草酸鎂組、還原型谷胱甘肽組及黃芩苷鎂鹽組，每組10只。空白對照組與模型組每天尾靜脈注射等體積的無菌生理鹽水；異甘草酸鎂組每天尾靜脈注射異甘草酸鎂18 mg/kg；還原型谷胱甘肽組每天尾靜脈注射還原型谷胱甘肽150 mg/kg；黃芩苷鎂鹽組按照100 mg/kg尾靜脈注射黃芩苷鎂鹽，每日1次，連續給藥1 w。末次給藥2 h后，各藥物組按1 ml/kg腹腔注射50%的CCl4溶液，空白對照組腹腔注射等體積的橄欖油溶液。禁食，自由飲水，24 h后用4%水合氯醛麻醉解剖大鼠，腹主動脈取血后迅速摘除肝臟，用預冷的生理鹽水清潔后于-80℃保存，用于后續的Western印跡和實時熒光定量-聚合酶鏈反應(PCR)，以檢測各組Nrf2、NQO1 和血紅素氧合酶(HO)-1的蛋白和mRNA 表達水平。

1.3.2Western印跡 -80℃冰箱取出肝組織樣本，眼科剪碎于研缽，隨后加入蛋白裂解液冰上研磨，裂解反應45 min，收集勻漿液至EP管中，置于4℃離心機進行離心(12 000 r/min離心15 min)，轉移上清至另一EP管，再次離心(12 000 r/min，15 min，4℃)，收集上清液并分裝，置于-80℃冰箱保存。隨后加入100 ml提前預冷的緩沖液在離心沉淀物中，渦旋振蕩15 s冰上靜置10 min，反復4次(冰上反應共40 min)；靜置結束后離心(16 000 r/min，10 min，4℃)，再將上清液移至另一預冷的無菌EP管中，最終得到的上清即為核蛋白。嚴格按照BCA定量試劑盒說明書進行蛋白定量，蛋白樣品與上樣緩沖液混勻后于100℃水浴鍋中變性5 min，配制10%分離膠和5%濃縮膠，上樣量為30 μg，80 V/30 min，120 V/1.5 h進行電泳。按照2 mA/cm2膜，恒流轉膜2 h。完成轉膜后將聚偏氟乙烯(PVDF)膜在含5% 脫脂奶粉的封閉液中封閉1 h，洗膜，加入稀釋好的一抗溶液(量根據膜面積以0.1 ml/cm2計算)，于搖床上室溫孵育1～2 h或4℃過夜。TBST洗膜4次，每次7 min。加二抗，搖床上室溫孵育1～2 h。ECL試劑盒顯影，圖像用Quantity one軟件分析，LaminB進行數據校正。

1.3.3實時熒光定量PCR 常規提取肝組織中的總RNA,按照試劑盒要求逆轉錄為cDNA,Nrf2、HO-1、NQO1及內參 GAPDH的引物分別為Nrf2：上游引物：5′-GACCTAAAGCACAGCCAACACAT-3′，下游引物：5′-CTCAATCGGCTTGAATGTTTGTC-3′；HO-1：上游引物：5′-TGTCCCAGGATTTGTCCGAG-3′，下游引物：5′-ACTGGGTTCTGCTTGTTTCGCT-3′；NQO1：上游引物：5′-GGGGACATGAACGTCATTC-TCT-3′,下游引物：5′-AGTGGTGACTCCTCCCAGACAG-3′；GAPDH：上游引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。按照試劑盒說明書進行PCR，利用 2-ΔΔCt法對基因表達進行相對定量分析。

1.4統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1Western印跡檢測Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達 與空白對照組比較，其余各組Nrf2蛋白水平均顯著升高，異甘草酸鎂組、還原型谷胱甘肽組、黃岑甘鎂鹽組HO-1、NQO1蛋白水平均顯著升高(均P<0.05)；與模型組比較，異甘草酸鎂組、還原型谷胱甘肽組、黃岑甘鎂鹽組Nrf2、HO-1、NQO1蛋白水平均顯著升高(均P<0.05)。見圖1、表1。

1～5：空白對照組，模型組，異苷草酸鎂組，還原型谷胱甘肽組，黃芩苷鎂鹽組圖1 Western印跡檢測各組Nrf2、HO-1、NQO1表達

表1 各組Nrf2、HO-1、NQO1蛋白水平比較

2.2各組Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA水平比較 與空白對照組比較，其余各組Nrf2 mRNA水平均顯著升高，異甘草酸鎂組、還原型谷胱甘肽組、黃岑甘鎂鹽組HO-1、NQO1 mRNA水平均顯著升高(均P<0.05)；與模型組比較，異甘草酸鎂組、還原型谷胱甘肽組、黃岑甘鎂鹽組Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA水平均顯著升高(均P<0.05)。見表2。

表2 各組Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA水平比較

3 討 論

研究發現，梨頭草提取物、青蒿琥酯、鬼針草水提物、雷公藤總苷、青藤堿等能通過緩解氧化應激和炎癥反應對CCl4誘導的急性肝損傷起到保護作用〔5～8〕。機體受到氧化應激刺激后，體內多種信號通路被激活，通過多種途徑介導肝細胞損傷。Nrf2/ARE信號通路可以通過調控Ⅱ相解毒酶及抗氧化物基因的表達來調控肝臟新陳代謝促進毒物外排起到抗氧化作用，同時還可以促進肝細胞再生，從而保護肝臟〔9～11〕。

在肝、腎等解毒器官中高表達的Nrf2是調控抗氧化重要轉錄因子〔12〕。胞質內Kelch 樣環氧氯丙烷相關蛋白(Keap)1是Nrf2的特異性受體。生理自穩狀態下，Nrf2位于細胞質中與Keap1耦聯，其活性被抑制，同時通過Keap1 介導的泛素化對Nrf2進行持續降解以維持與轉錄形成的Nrf2之間的平衡〔13〕。當機體受到氧化應激刺激后，Keap1介導的泛素化被阻止，同時Keap1 的構像發生改變，使Nrf2 與Keapl 發生解耦聯,Nrf2 從胞質轉位至細胞核并與下游的目的基因ARE 結合，從而啟動下游多個抗炎、抗氧化蛋白及解毒酶等基因的表達，進而激活Nrf2 信號通路，發揮抗氧化作用，促進機體毒物的外排〔14〕。有研究表明敲除Nrf2基因的小鼠，肝臟中丙二醛(MDA)水平會顯著升高，小鼠會表現出嚴重的肝損傷。相反激活Nrf2及其下游基因HO-1表達，可降低體內MDA和ROS水平，減輕過氧化反應所引起的肝損傷〔15〕。

傳統醫學用黃芩治療濕熱黃疸等肝膽病，黃芩苷鎂鹽是其有效成分黃芩苷在藥材中的存在形式，研究證明黃芩苷能抗氧化，對CCl4致大鼠肝損傷有保護作用〔3〕，且黃芩苷鎂鹽水溶性好，比黃芩苷更容易被吸收。本研究結果表明黃芩苷鎂鹽能夠顯著促進Nrf2蛋白的活化及核內基因的表達，Nrf2活化后入核與ARE結合，激活Nrf2/ARE信號通路，啟動下游HO-1和NQO1基因表達，促進HO-1和NQO1蛋白合成。本研究結果說明黃芩苷鎂鹽在CCl4誘導大鼠的急性肝損傷模型體內，能夠調控Nrf2/ARE信號通路。還原型谷胱甘肽具有較強清除自由基、抑制胞膜脂質過氧化作用，本研究結果說明GSH能夠通過調節氧化系統和抗氧化系統平衡，對CCl4誘導的肝細胞損傷起到保護作用。黃芩苷鎂鹽對CCl4誘導的急性肝損傷保護作用機制可能與Nrf2/ARE信號通路被激活有關，通過上調下游HO-1和NQO1 mRNA及蛋白的表達水平，進而發揮抗氧化作用，降低肝組織中MDA水平，促進機體毒物外排，從而減輕CCl4對肝臟的損傷程度。

此外，本研究還發現單獨給予CCl4造模也可提高Nrf2的核內表達，這可能是由于外界刺激，肝細胞防御性應激反應所導致的。但急性肝損傷的發生發展是一個及其復雜的過程，多種機制參與，黃芩苷鎂鹽對急性肝損傷的保護作用，可能還會通過其他的途徑進行調控，有待日后進一步研究。