miR-141對老年骨質疏松性骨折大鼠預后的影響及相關機制

伏守用 宋國 梅皓 蘇杭 金龍浩 (延邊大學附屬醫院(延邊醫院)骨一科，吉林 延邊 133000)

隨著年齡增長，骨質疏松發生率明顯提升，骨骼風險相應增加〔1〕。骨質疏松性骨折患者生活質量下降的同時也占用了大量醫療資源。雖然近年來骨質疏松治療取得了明顯進步，涌現出了合成代謝、抗再吸收等多種藥物，但總體治療效果仍不夠理想〔2〕。研發加速骨修復過程的新治療方案對改善骨質疏松性骨折患者預后具有重要意義。小分子RNA(miRNA)在調節基因表達方面作用明顯，能夠參與調控骨質疏松的發生與發展及骨折的修復過程〔3〕。本研究經miRBase數據庫預測，miR-141可與Notch1靶向結合。Notch信號通路參與介導骨骼發育、骨重塑、組織重生過程，表達異常會引發多種骨骼疾病〔4〕。本研究旨在探討miR-141對老年骨質疏松性骨折大鼠預后的影響及相關機制。

1 材料與方法

1.1動物與主要試劑 18月齡Wistar大鼠76只均為雌性，體重(350±50)g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK(京)2020-0004。溫濕度恒定，燈光模擬晝夜交替，標準固體飼料喂養，引用蒸餾水。人腎上皮細胞系293T細胞購于上海通派生物有限公司；miR-141 mimic、miR-nc、miR-141抑制劑、Notch1 siRNA均購于上海權陽生物有限公司；Trizol試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒購于北京賽爾瑞成生物科學有限公司。骨形態發生蛋白(BMP)-2一抗購于北京中科物源生物有限公司。

1.2骨質疏松大鼠模型建立與檢測 大鼠術前禁食6 h，按3 ml/kg劑量腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，骨質疏松模型組60只大鼠在無菌條件下經背部入路，切除雙側卵巢；假手術組16只同樣經背部入路，但不切除雙側卵巢，僅切除卵巢周圍相同質量的脂肪組織。之后自由飲食，飼養3個月，隨機數字法從60只骨質疏松模型組大鼠中選取8只，從假手術組中選取8只，再次麻醉，測量骨密度和股骨端組織標本組織中miR-141、Notch1基因表達情況。

1.3骨質疏松性骨折大鼠模型建立與分組 隨機選取骨質疏松模型大鼠40只，禁食6 h，按3 ml/kg劑量腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，隨機選取大鼠單側股骨，剃毛并用碘伏消毒后，做股骨中點外側縱行切開骨膜，鋸斷股骨后使用克氏針進行髓內固定，縫合切口。根據隨機數字法分為骨質疏松性骨折模型組、陰性對照組(轉染miR-141抑制劑陰性對照)、miR-141抑制劑組(轉染miR-141抑制劑)、Notch1 siRNA干擾組(轉染Notch1 siRNA)、miR-141抑制劑+Notch1 siRNA干擾組(轉染miR-141抑制劑和Notch1 siRNA)，每組8只。具體轉染方法：骨折手術7 d后，向對應大鼠皮下注射200 μl含轉染試劑的核酸溶液，1次/w，連續注射4 w，進行后續實驗。同時取假手術組8只大鼠，骨折模型建立方法與骨質疏松模型大鼠一致。

1.4雙熒光素酶報告實驗 使用miRBase數據庫預測miR-141與Notch1的結合位點，進行雙熒光素酶報告實驗驗證二者的靶向調節作用。將Notch1基因非編碼區端野生型質粒克隆至應該報告質粒中，之后分別與miR-141 mimic、miR-nc共轉染至293T細胞中，分為Notch1/miR-nc組、Notch1/miR-141 mimic組，每組設5個平行對照，轉染48 h后使用雙熒光素酶報告試劑盒檢測熒光活性，以海腎熒光素酶為內參計算螢火蟲熒光素酶活性的相對值。

1.5qRT-PCR檢測miR-141、Notch1表達水平 Trizol試劑盒提取各組股骨斷端組織總RNA，測定濃度和純度后取3 μg RNA，按照cDNA第一鏈合成試劑盒說明操作，逆轉錄成互補DNA。PCR擴增引物由上海士鋒生物有限公司設計合成，miR-141正向引物：5′-GTTCTGGATGGACAGGTCGACCTC-3′，反向引物：5′-ACCTCGGGAGTTGACTTAACGGCTGA-3′。Notch1正向引物：5′-TCCATCTGCTACCTCGGT-3′，反向引物：5′-CTTACTCTGCCACTGCTA-3′。GAPDH正向引物：5′-TTCAGTCTCCTCTGGTGGACC-3′，反向引物：5′-GCTTAGCGATGATTCGTTGA-3′。PCR反應設定條件：94℃預變性2 min，95℃變性30 s，57℃復性30 s，共45個循環，72℃延伸1 min。以2-△△Ct表示目的基因的表達水平。

1.6各組骨組織中BMP-2表達的免疫組化檢測 取各組大鼠股骨斷端組織，常規固定、脫鈣、石蠟包埋后5 μm切片，脫蠟并水化組織切片，高壓熱修復抗原。使用3%過氧化氫室溫下處理10 min，使內源性過氧化物酶失活，5%正常山羊血清封閉，37℃靜置10 min，滴加BMP-2一抗(1∶500稀釋)，4℃孵育12 h，次日滴加相應的二抗(1∶2 000稀釋)，37℃孵育1 h，二氨基聯苯胺顯色，蘇木素復染，蒸餾水沖洗后脫水、透明、封片，光學顯微鏡下每張切片隨機選擇一個視野，棕黃色為BMP-2陽性表達，計數BMP-2陽性細胞個數。

1.7骨密度和生物力學檢測 分別于干預14、28、42、56 d時使用雙能X射線骨密度儀檢測手術側股骨的骨密度值。干預56 d時去除大鼠手術側股骨周圍肌肉等軟組織，拔除克氏針后進行三點彎曲實驗，測定極限應力、剪切應力、最大負載。

1.8統計學分析 采用SPSS24.0軟件進行方差分析和t檢驗。

2 結 果

2.1兩組骨密度及miR-141、Notch1基因表達水平比較 骨質疏松組骨密度明顯低于假手術組(P<0.01)；骨質疏松組miR-141表達水平明顯高于假手術組，Notch1表達水平明顯低于假手術組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組骨密度及miR-141、Notch1基因表達水平比較

2.2miR-141與Notch1靶向結合關系 兩組內參海腎熒光素酶熒光強度差異無統計學意義(P>0.05)；Notch1/miR-141 mimic組螢火蟲熒光素酶熒光強度及螢火蟲熒光素酶/海腎熒光素酶比值均明顯低于Notch1/miR-nc組(P<0.05)。見表2。

表2 miR-141與Notch1靶向結合關系的雙熒光素酶實驗結果

2.3各組體內miR-141、Notch1表達水平比較 miR-141抑制劑組、miR-141抑制劑+Notch1 siRNA干擾組miR-141表達水平(0.57±0.05、0.64±0.09)低于骨質疏松性骨折模型組(1.82±0.13)、陰性對照組(1.89±0.11)、假手術組(1.01±0.09)，差異有統計學意義(P<0.05)；miR-141表達水平在骨質疏松性骨折模型組、陰性對照組、miR-141抑制劑組(0.57±0.05)之間差異無統計學意義(P>0.05)。Notch1 siRNA干擾組Notch1表達水平(0.38±0.05)低于骨質疏松性骨折模型組(0.72±0.11)、陰性對照組(0.70±0.07)、假手術組(1.00±0.07)，差異有統計學意義(P<0.05)；miR-141抑制劑組(0.91±0.14)、miR-141抑制劑+Notch1 siRNA干擾組(0.79±0.07)Notch1表達水平高于Notch1 siRNA干擾組、骨質疏松性骨折模型組、陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；Notch1表達水平在骨質疏松性骨折模型組、陰性對照組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4各組骨組織中BMP-2表達比較 BMP-2主要分布于成骨細胞的胞質內和骨小梁周圍。假手術組陽性細胞數〔(157.00±16.00)個〕多于骨質疏松性骨折模型組〔(46.00±9.00)個〕，差異有統計學意義(P<0.01)；陽性細胞數在陰性對照組〔(48.00±11.00)個〕與骨質疏松性骨折模型組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)；miR-141抑制劑組陽性細胞數〔(139.00±18.00)個〕多于骨質疏松性骨折模型組、陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；miR-141抑制劑+Notch1 siRNA干擾組〔(105.00±13.00)個〕低于miR-141抑制劑組，但與Notch1 siRNA干擾組〔(32.00±7.00)個〕相比明顯增多，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組骨組織中BMP-2表達(SP法，×200)

2.5不同干預時間各組骨密度比較 除假手術組之外，其他各組隨著干預時間的延長骨密度呈逐漸上升趨勢；各干預時間點，骨質疏松性骨折模型組和陰性對照組明顯低于假手術組(P<0.05)；陰性對照組與骨質疏松性骨折模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)；miR-141抑制劑組明顯高于骨質疏松性骨折模型組、陰性對照組(P<0.05)；miR-141抑制劑+Notch1 siRNA干擾組明顯低于miR-141抑制劑組，但與Notch1 siRNA干擾組相比明顯升高(P<0.05)。見表3。

表3 不同干預時間各組骨密度比較

2.6干預56 d后各組股骨生物力學指標比較 骨質疏松性骨折模型組和陰性對照組極限應力、剪切應力、最大負載明顯低于假手術組(P<0.05)；陰性對照組與骨質疏松性骨折模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)；miR-141抑制劑組各股骨生物力學指標均明顯高于骨質疏松性骨折模型組、陰性對照組(P<0.05)；miR-141抑制劑+Notch1 siRNA干擾組均明顯低于miR-141抑制劑組，但與Notch1 siRNA干擾組相比明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 干預56 d后各組股骨生物力學指標比較

3 討 論

隨著我國經濟的快速發展和人口老齡化進程的加劇，骨質疏松已成為影響居民健康的主要疾病之一，由于骨質疏松患者骨骼質量較差，對于合并骨質疏松的骨折患者治療難度明顯增加〔5〕。隨著近年來分子生物學技術的快速發展，對miRNA的研究不斷深入，基于miRNA的分子靶向療法在臨床多種疾病的治療中展現出了較大潛力，其中包括對骨質疏松及合并骨折患者的治療〔6〕。相關研究顯示，miR-210能夠抑制破骨細胞活性和骨再吸收，用于骨質疏松的臨床治療〔7〕。亦有研究顯示，miR-128能夠調節人間充質干細胞的成骨分化，影響骨質疏松的發生與發展〔8〕。Notch受體參與調節人體內環境穩態和骨骼發育過程，骨細胞中Notch激活后能夠明顯提升骨骼質量〔9〕，同時能夠抑制骨再吸收，促進骨骼發育成熟〔10,11〕。本研究結果提示miR-141、Notch1在骨質疏松性骨折大鼠中存在異常表達。

本研究結果說明miR-141與Notch1之間存在靶向關系。BMP-2具有誘導骨再生的活性，能夠促進骨髓間充質肝細胞向成骨細胞分化，促進骨形成和骨骼再生〔12,13〕。本研究結果提示Notch1低表達能夠明顯抑制骨質疏松性骨折大鼠骨組織中BMP-2表達，抑制miR-141表達可能通過上調Notch1表達水平來促進BMP-2陽性表達。

進一步分析各組大鼠骨密度和生物力學改變情況，結果提示抑制miR-141能夠明顯提升骨質疏松性骨折大鼠的骨密度及生物力學相關指標；抑制Notch1后骨質疏松性骨折大鼠的骨密度及生物力學相關指標明顯降低，而抑制miR-141能夠逆轉上述改變。可推測抑制Notch1能夠促進Notch1表達來促進骨質疏松性骨折大鼠的骨骼修復。

綜上，miR-141與Notch1靶向結合能夠影響骨質疏松性骨折大鼠骨代謝和生物力學相關指標的改變。通過抑制miR-141表達能夠上調Notch1表達，提升骨質疏松性骨折大鼠骨組織中BMP-2的陽性表達率，進而提升骨密度和生物力學強度，促進骨折愈合。