2種實時熒光定量聚合酶鏈式反應法檢測HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者血清HBV RNA的一致性分析

王 揚， 廖 昊， 鄧中平， 卞丹丹， 任 艷， 蔣瑩瑩， 劉 霜， 陳 煜，魯鳳民， 段鐘平， 鄭素軍

1 首都醫科大學附屬北京佑安醫院 疑難肝病與人工肝中心， 北京 100069； 2 北京大學基礎醫學院 病原生物學系暨感染病中心， 北京 100191； 3 北京大學 前沿交叉學科研究院， 北京 100871； 4 基因診斷技術湖南省 重點實驗室， 長沙 410205； 5首都醫科大學電力教學醫院 感染性疾病科， 北京 100073

全世界約2.92億人感染HBV[1]，HBV感染是慢性乙型肝炎(CHB)、肝硬化、肝衰竭和肝細胞癌(HCC)的主要致病因素[2]。HBV DNA定量、HBeAg和HBsAg定量可以反映病毒復制活躍程度[3]，但是僅以此作為CHB患者接受患者核苷(酸)類似物(NUC)或干擾素治療期間療效監測、方案管理是不夠的，尤其是經長期抗病毒治療后HBV DNA水平低于試劑盒檢測下限的患者。新近累積的證據表明，血清HBV RNA定量可以反映共價閉合環狀DNA (cccDNA)復制活躍程度并且與組織學變化相關[4]，預測NUC治療中的早期病毒耐藥[5]，與接受NUC或干擾素治療的CHB患者應答相關[6-7]。國內目前有基于實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time PCR)技術的S(Shengxiang)、X (Xinbo) HBV pgRNA核酸檢測試劑可供使用，但是HBeAg血清學轉換與未轉換CHB患者間HBV RNA定量結果差異顯著[8]，而且不同試劑在臨床樣本中檢測結果的一致性尚未知曉。在本研究中，筆者擬評價兩種試劑檢測方法在臨床樣本檢測結果中的相關性和一致性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 對前瞻性收集于2007年7月—2008年8月首都醫科大學附屬北京佑安醫院疑難肝病及人工肝中心組建的108例CHB患者隊列，其中HBeAg陽性患者83例，回顧性分析基線、12周、24周及48周的數據。符合入組條件的病例連續入組，入組標準：(1)男性或女性年齡≥16歲；(2)CHB的診斷及治療標準符合2005年《慢性乙型肝炎防治指南》[9]。排除標準：(1)其他原因造成的活動性肝病或合并其他病毒感染，包括：HCV、HDV、HIV，或存在自身免疫性肝病；(2)除乙型肝炎外有其他重大身心疾病，如嚴重心臟病、腎臟疾病等；(3)腎臟功能下降(肌酐清除率<50 mL/min)需要減少藥物使用劑量者；(4)依從性差者；(5)既往惡性腫瘤病史，包括HCC、原位癌和肝臟不典型增生結節，不行肝移植預期壽命少于1年者；(6)精神疾病患者；(7)入組前6個月接受皮質類固醇藥物、免疫抑制劑和化療藥物者；(8)女性妊娠、哺乳者。

1.2 血液生物化學、病毒學指標檢測 肝功能、生化等檢測由首都醫科大學附屬北京佑安醫院檢驗中心完成，使用自動生化檢測器(AU640生化分析儀，OLYMPUS，日本)進行ALT和AST等生化指標的測定。使用電化學發光免疫測定法(Abbott Laboratories，Chicago，IL，USA)，在Roche Cobas e601分析儀上測定血清HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe和抗-HBc。使用Elecsys進行HBsAg定量(Roche Diagnostics)，最低檢測限為0.05 IU/mL。使用Cobas HBV Amplicor Monitor測定法(Roche Diagnostics,Pleasanton,CA,USA)測定血清HBV DNA水平，最低檢測下限為50 IU/mL。

1.3 HBV RNA定量檢測 S試劑法：采用S公司HBV RNA定量檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)，具體操作過程如既往文獻[3,10-11]所述。X試劑法操作如下：HBV RNA用核酸提取或純化試劑盒(Xinbo公司，科研用試劑)分離，并用配套的DNase I處理450 μL血清中的核酸。DNase I處理中，包含待測血清樣本以及陰性對照品、陽性對照品、消化對照品，每種反應混合物均包含4 μL DNase I反應緩沖液(10×)，4 μL DNAse I(不含RNase)和40 μL核酸。標準品中加入48 μL洗脫液(替代4 μL Dnase I和4 μL 10×buffer)，混勻。在37 ℃下反應30 min，再加入40 μL 4 mmol/L EDTA，混勻，接著將每種混合物在65 °C孵育10 min以使DNase I失活，標準品不參與加熱，不加EDTA終止。最后，使用HBV pgRNA高靈敏定量試劑盒(Xinbo公司,科研用)對DNase I處理的HBV RNA進行一步逆轉錄和實時熒光定量PCR檢測。使用ABI7500熒光定量PCR系統(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)測量血清HBV RNA水平，其擴增條件：在95 °C變性1 min，37 ℃ 2 min，逆轉錄50 ℃ 5 min，逆轉錄42 ℃ 20 min；94 ℃變性10 min，94 ℃變性30 s 45個循環，62 ℃ 45 s退火(收集熒光信號)。擴增結果被自動分析。測定的最低下限為200 拷貝/mL。

2 結果

2.1 一般資料 83例HBeAg陽性患者，隨訪108(18～138)個月，37例(44.58%)發生HBeAg血清學轉換，隨機選取20例發生HBeAg血清學轉換患者，基于性別、年齡、使用藥物種類(ETV vs ADV)和HBV DNA載量，容差0.04進行1∶1匹配，納入20例HBeAg血清學未轉換患者的臨床資料，兩組患者基線資料中BMI、基因型構成、ALT、AST、AST/ALT、TBil、ALP、PLT和HBsAg定量之間，差異均無統計學意義(P值均>0.05)(表1)。

表1 HBeAg轉換與未轉換患者基線時一般臨床特征

2.2 HBV RNA檢測結果比較 40例患者基線、隨訪12、24及48周數據納入此項分析，其中X試劑檢測154份血清樣本，S試劑檢測132份血清樣本，兩種試劑對送檢樣本中HBV RNA檢出率均為100%。

兩種試劑共同檢測血清樣本131份，各隨訪時間點血清樣本數分別為34、29、35及33份，X試劑檢測HBV RNA定量數據均高于S試劑，差異均具有統計學意義(P值均<0.001)(表2)。兩種檢測方法中，隨著治療延續，HBeAg轉換和未轉換組HBV RNA定量均呈下降趨勢，且X試劑檢測HBV RNA定量數據均高于S試劑，差異均具有統計學意義(P值均<0.05)(圖1)。

表2 HBV RNA定量檢測結果比較

圖1 兩種檢測方法在HBeAg轉換和未轉換患者中測得的HBV RNA定量動態變化

2.3 HBV RNA定量檢測結果一致性評價 兩種檢測方法相關系數如表3所示。總體樣本中，r和ICC分別為0.916(95%CI：0.883～0.940)和0.777(95%CI：-0.003～0.926)(P值均<0.05)。在基線、隨訪12周、24周及48周，兩種檢測方法r及ICC分別為0.915(95%CI：0.836～0.957)與0.771(95%CI：-0.021～0.931)、0.849(95%CI：0.701～0.927)與0.733(95%CI：0.138～0.902)、0.951(95%CI：0.905～0.975)與0.776(95%CI：-0.058～0.942)、0.933(95%CI：0.867～0.967)與0.804(95%CI：-0.014～0.944)(P值均<0.05)。在HBeAg轉換及未轉換患者血清中，兩種方法檢測結果之間的相關性見表3。

表3 兩種方法檢測HBV RNA定量結果之間的相關性

Bland-Altman法一致性分析結果如圖2所示。兩種檢測方法中，96.18%(126/131)的差異位于平均差±1.96標準差之間，方法間定量差異<1 log、1～2 log和>2 log的樣本比例分別為54.96%(72/131)、42.75%(56/131)和2.29%(3/131)。兩種方法間差值均數為0.93(95%CI：-0.36～2.22)log10拷貝/mL，差值最大為4.66 log10拷貝/mL。在HBeAg轉換和未轉換患者中，方法間差異位于平均差±1.96標準差之間的比例分別為95.08%(58/61)和97.14%(68/70)。

注：用X和S試劑在131份CHB患者臨床血清中檢測的HBV RNA水平，縱坐標為檢測結果的兩種試劑檢測結果的差值，虛線之間的區域對應于平均差±1.96標準差。

3 討論

歐洲肝病學會和國內最新的CHB管理指南[14-15]中，血清HBV RNA定量作為新型的病毒學標志物出現，新近的研究中，其不僅可以反映cccDNA復制活躍程度并且與組織學變化相關[4]，在預測NUC治療中的早期病毒耐藥[5]、抗病毒治療應答[6-7]及評估NUC停藥后復發風險方面[10,16]具有潛在的臨床應用價值。但是，目前的局限性在于不同研究團隊采用的檢測方法不完全相同。本研究首次比較國內目前可用的兩種HBV pgRNA核酸檢測試劑盒，結果表明，X檢測試劑定量結果讀數高于S檢測試劑結果，但兩種試劑HBV RNA定量結果的相關性及一致性良好。

HBeAg陽性CHB患者使用NUC長期抗病毒治療過程中，兩種試劑定量檢測結果均反映HBV RNA水平的動態變化過程。即無論在HBeAg轉換或未轉換患者中，HBV RNA定量水平隨治療時間的延長均呈現逐漸下降趨勢，與其他真實世界HBeAg陽性CHB患者NUC抗病毒治療長期隨訪研究結果類似[8,17]。第二，既往有研究[17]表明，HBV RNA水平在HBeAg轉換組顯著低于未轉換組，并且在抗病毒治療早期下降更快。此外，HBV RNA和HBeAg水平在治療基線和治療早期中均具有相關性，可能提示HBV RNA和HBeAg mRNA均轉錄自cccDNA。為避免因HBeAg轉換未轉換構成差異導致比較結果出現偏倚，筆者使用傾向性評分對HBeAg轉換未轉換人群進行1∶1匹配，在一般資料均衡情況下，研究結果表明，不管HBeAg轉換或未轉換，在12、24及48周隨訪中，兩種試劑定量檢測HBV RNA結果均呈現較強的正相關性，提示兩種試劑檢測結果可能均反映了cccDNA的轉錄[11,18-20]。第三，與X試劑檢測結果相比，S試劑檢測結果HBV RNA讀數較低，且二者差異具有統計學意義(P值均<0.05)，提示S檢測試劑靈敏度可能較高或線性范圍更廣，但目前仍然缺乏HBV RNA檢測試劑標準品進行直接比較，仍需要進一步的深入研究。

HBeAg陽性CHB患者長期NUC抗病毒治療過程中，Bland-Altman法一致性分析結果提示，兩種試劑對HBV RNA定量檢測結果中96.18%的差異位于平均差±1.96標準差之間，97.71%(128/131)樣本之間的差異<2 log。造成兩種方法檢測結果之間的差異，可能的原因包括核酸的提取，洗脫液量、模板量、PCR反應體積及擴增靶區的不同等。這也提示了臨床檢驗中需要標準化的檢測流程及質控體系。除此之外，HBeAg陰性患者及使用干擾素抗病毒治療過程中，兩種試劑檢測結果的一致性仍有待于進一步的研究。

綜上所述，在臨床HBeAg陽性CHB患者血清中，S和X檢測試劑實時HBV RNA定量檢測結果之間具有很強的相關性和良好的一致性，但不同實驗室檢測流程的標準化仍需要進一步改進。

倫理學聲明：本研究經由首都醫科大學附屬北京佑安醫院倫理委員會批準，批號：京佑科倫字〔2019〕056號。所納入患者均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：王揚負責整理、統計數據并撰寫初稿；廖昊、鄧中平給予試驗平臺及負責試驗操作；卞丹丹、任艷及蔣瑩瑩負責臨床數據及血清樣本的收集、整理及分析；劉霜、陳煜負責管理項目實施；魯鳳民、段鐘平、鄭素軍負責研究設計，嚴格審閱及修訂稿件并批準最終版本投稿。所有作者審閱稿件并參與稿件的修訂。