2種實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者血清HBV RNA的一致性分析

王 揚(yáng)， 廖 昊， 鄧中平， 卞丹丹， 任 艷， 蔣瑩瑩， 劉 霜， 陳 煜，魯鳳民， 段鐘平， 鄭素軍

1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院 疑難肝病與人工肝中心， 北京 100069； 2 北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)系暨感染病中心， 北京 100191； 3 北京大學(xué) 前沿交叉學(xué)科研究院， 北京 100871； 4 基因診斷技術(shù)湖南省 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 長沙 410205； 5首都醫(yī)科大學(xué)電力教學(xué)醫(yī)院 感染性疾病科， 北京 100073

全世界約2.92億人感染HBV[1]，HBV感染是慢性乙型肝炎(CHB)、肝硬化、肝衰竭和肝細(xì)胞癌(HCC)的主要致病因素[2]。HBV DNA定量、HBeAg和HBsAg定量可以反映病毒復(fù)制活躍程度[3]，但是僅以此作為CHB患者接受患者核苷(酸)類似物(NUC)或干擾素治療期間療效監(jiān)測、方案管理是不夠的，尤其是經(jīng)長期抗病毒治療后HBV DNA水平低于試劑盒檢測下限的患者。新近累積的證據(jù)表明，血清HBV RNA定量可以反映共價(jià)閉合環(huán)狀DNA (cccDNA)復(fù)制活躍程度并且與組織學(xué)變化相關(guān)[4]，預(yù)測NUC治療中的早期病毒耐藥[5]，與接受NUC或干擾素治療的CHB患者應(yīng)答相關(guān)[6-7]。國內(nèi)目前有基于實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time PCR)技術(shù)的S(Shengxiang)、X (Xinbo) HBV pgRNA核酸檢測試劑可供使用，但是HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換與未轉(zhuǎn)換CHB患者間HBV RNA定量結(jié)果差異顯著[8]，而且不同試劑在臨床樣本中檢測結(jié)果的一致性尚未知曉。在本研究中，筆者擬評(píng)價(jià)兩種試劑檢測方法在臨床樣本檢測結(jié)果中的相關(guān)性和一致性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 對(duì)前瞻性收集于2007年7月—2008年8月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院疑難肝病及人工肝中心組建的108例CHB患者隊(duì)列，其中HBeAg陽性患者83例，回顧性分析基線、12周、24周及48周的數(shù)據(jù)。符合入組條件的病例連續(xù)入組，入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)男性或女性年齡≥16歲；(2)CHB的診斷及治療標(biāo)準(zhǔn)符合2005年《慢性乙型肝炎防治指南》[9]。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)其他原因造成的活動(dòng)性肝病或合并其他病毒感染，包括：HCV、HDV、HIV，或存在自身免疫性肝??；(2)除乙型肝炎外有其他重大身心疾病，如嚴(yán)重心臟病、腎臟疾病等；(3)腎臟功能下降(肌酐清除率<50 mL/min)需要減少藥物使用劑量者；(4)依從性差者；(5)既往惡性腫瘤病史，包括HCC、原位癌和肝臟不典型增生結(jié)節(jié)，不行肝移植預(yù)期壽命少于1年者；(6)精神疾病患者；(7)入組前6個(gè)月接受皮質(zhì)類固醇藥物、免疫抑制劑和化療藥物者；(8)女性妊娠、哺乳者。

1.2 血液生物化學(xué)、病毒學(xué)指標(biāo)檢測 肝功能、生化等檢測由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院檢驗(yàn)中心完成，使用自動(dòng)生化檢測器(AU640生化分析儀，OLYMPUS，日本)進(jìn)行ALT和AST等生化指標(biāo)的測定。使用電化學(xué)發(fā)光免疫測定法(Abbott Laboratories，Chicago，IL，USA)，在Roche Cobas e601分析儀上測定血清HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe和抗-HBc。使用Elecsys進(jìn)行HBsAg定量(Roche Diagnostics)，最低檢測限為0.05 IU/mL。使用Cobas HBV Amplicor Monitor測定法(Roche Diagnostics,Pleasanton,CA,USA)測定血清HBV DNA水平，最低檢測下限為50 IU/mL。

1.3 HBV RNA定量檢測 S試劑法：采用S公司HBV RNA定量檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)，具體操作過程如既往文獻(xiàn)[3,10-11]所述。X試劑法操作如下：HBV RNA用核酸提取或純化試劑盒(Xinbo公司，科研用試劑)分離，并用配套的DNase I處理450 μL血清中的核酸。DNase I處理中，包含待測血清樣本以及陰性對(duì)照品、陽性對(duì)照品、消化對(duì)照品，每種反應(yīng)混合物均包含4 μL DNase I反應(yīng)緩沖液(10×)，4 μL DNAse I(不含RNase)和40 μL核酸。標(biāo)準(zhǔn)品中加入48 μL洗脫液(替代4 μL Dnase I和4 μL 10×buffer)，混勻。在37 ℃下反應(yīng)30 min，再加入40 μL 4 mmol/L EDTA，混勻，接著將每種混合物在65 °C孵育10 min以使DNase I失活，標(biāo)準(zhǔn)品不參與加熱，不加EDTA終止。最后，使用HBV pgRNA高靈敏定量試劑盒(Xinbo公司,科研用)對(duì)DNase I處理的HBV RNA進(jìn)行一步逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。使用ABI7500熒光定量PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)測量血清HBV RNA水平，其擴(kuò)增條件：在95 °C變性1 min，37 ℃ 2 min，逆轉(zhuǎn)錄50 ℃ 5 min，逆轉(zhuǎn)錄42 ℃ 20 min；94 ℃變性10 min，94 ℃變性30 s 45個(gè)循環(huán)，62 ℃ 45 s退火(收集熒光信號(hào))。擴(kuò)增結(jié)果被自動(dòng)分析。測定的最低下限為200 拷貝/mL。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 83例HBeAg陽性患者，隨訪108(18～138)個(gè)月，37例(44.58%)發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，隨機(jī)選取20例發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換患者，基于性別、年齡、使用藥物種類(ETV vs ADV)和HBV DNA載量，容差0.04進(jìn)行1∶1匹配，納入20例HBeAg血清學(xué)未轉(zhuǎn)換患者的臨床資料，兩組患者基線資料中BMI、基因型構(gòu)成、ALT、AST、AST/ALT、TBil、ALP、PLT和HBsAg定量之間，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表1)。

表1 HBeAg轉(zhuǎn)換與未轉(zhuǎn)換患者基線時(shí)一般臨床特征

2.2 HBV RNA檢測結(jié)果比較 40例患者基線、隨訪12、24及48周數(shù)據(jù)納入此項(xiàng)分析，其中X試劑檢測154份血清樣本，S試劑檢測132份血清樣本，兩種試劑對(duì)送檢樣本中HBV RNA檢出率均為100%。

兩種試劑共同檢測血清樣本131份，各隨訪時(shí)間點(diǎn)血清樣本數(shù)分別為34、29、35及33份，X試劑檢測HBV RNA定量數(shù)據(jù)均高于S試劑，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.001)(表2)。兩種檢測方法中，隨著治療延續(xù)，HBeAg轉(zhuǎn)換和未轉(zhuǎn)換組HBV RNA定量均呈下降趨勢，且X試劑檢測HBV RNA定量數(shù)據(jù)均高于S試劑，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(圖1)。

表2 HBV RNA定量檢測結(jié)果比較

圖1 兩種檢測方法在HBeAg轉(zhuǎn)換和未轉(zhuǎn)換患者中測得的HBV RNA定量動(dòng)態(tài)變化

2.3 HBV RNA定量檢測結(jié)果一致性評(píng)價(jià) 兩種檢測方法相關(guān)系數(shù)如表3所示?？傮w樣本中，r和ICC分別為0.916(95%CI：0.883～0.940)和0.777(95%CI：-0.003～0.926)(P值均<0.05)。在基線、隨訪12周、24周及48周，兩種檢測方法r及ICC分別為0.915(95%CI：0.836～0.957)與0.771(95%CI：-0.021～0.931)、0.849(95%CI：0.701～0.927)與0.733(95%CI：0.138～0.902)、0.951(95%CI：0.905～0.975)與0.776(95%CI：-0.058～0.942)、0.933(95%CI：0.867～0.967)與0.804(95%CI：-0.014～0.944)(P值均<0.05)。在HBeAg轉(zhuǎn)換及未轉(zhuǎn)換患者血清中，兩種方法檢測結(jié)果之間的相關(guān)性見表3。

表3 兩種方法檢測HBV RNA定量結(jié)果之間的相關(guān)性

Bland-Altman法一致性分析結(jié)果如圖2所示。兩種檢測方法中，96.18%(126/131)的差異位于平均差±1.96標(biāo)準(zhǔn)差之間，方法間定量差異<1 log、1～2 log和>2 log的樣本比例分別為54.96%(72/131)、42.75%(56/131)和2.29%(3/131)。兩種方法間差值均數(shù)為0.93(95%CI：-0.36～2.22)log10拷貝/mL，差值最大為4.66 log10拷貝/mL。在HBeAg轉(zhuǎn)換和未轉(zhuǎn)換患者中，方法間差異位于平均差±1.96標(biāo)準(zhǔn)差之間的比例分別為95.08%(58/61)和97.14%(68/70)。

注：用X和S試劑在131份CHB患者臨床血清中檢測的HBV RNA水平，縱坐標(biāo)為檢測結(jié)果的兩種試劑檢測結(jié)果的差值，虛線之間的區(qū)域?qū)?yīng)于平均差±1.96標(biāo)準(zhǔn)差。

3 討論

歐洲肝病學(xué)會(huì)和國內(nèi)最新的CHB管理指南[14-15]中，血清HBV RNA定量作為新型的病毒學(xué)標(biāo)志物出現(xiàn)，新近的研究中，其不僅可以反映cccDNA復(fù)制活躍程度并且與組織學(xué)變化相關(guān)[4]，在預(yù)測NUC治療中的早期病毒耐藥[5]、抗病毒治療應(yīng)答[6-7]及評(píng)估NUC停藥后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)方面[10,16]具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。但是，目前的局限性在于不同研究團(tuán)隊(duì)采用的檢測方法不完全相同。本研究首次比較國內(nèi)目前可用的兩種HBV pgRNA核酸檢測試劑盒，結(jié)果表明，X檢測試劑定量結(jié)果讀數(shù)高于S檢測試劑結(jié)果，但兩種試劑HBV RNA定量結(jié)果的相關(guān)性及一致性良好。

HBeAg陽性CHB患者使用NUC長期抗病毒治療過程中，兩種試劑定量檢測結(jié)果均反映HBV RNA水平的動(dòng)態(tài)變化過程。即無論在HBeAg轉(zhuǎn)換或未轉(zhuǎn)換患者中，HBV RNA定量水平隨治療時(shí)間的延長均呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，與其他真實(shí)世界HBeAg陽性CHB患者NUC抗病毒治療長期隨訪研究結(jié)果類似[8,17]。第二，既往有研究[17]表明，HBV RNA水平在HBeAg轉(zhuǎn)換組顯著低于未轉(zhuǎn)換組，并且在抗病毒治療早期下降更快。此外，HBV RNA和HBeAg水平在治療基線和治療早期中均具有相關(guān)性，可能提示HBV RNA和HBeAg mRNA均轉(zhuǎn)錄自cccDNA。為避免因HBeAg轉(zhuǎn)換未轉(zhuǎn)換構(gòu)成差異導(dǎo)致比較結(jié)果出現(xiàn)偏倚，筆者使用傾向性評(píng)分對(duì)HBeAg轉(zhuǎn)換未轉(zhuǎn)換人群進(jìn)行1∶1匹配，在一般資料均衡情況下，研究結(jié)果表明，不管HBeAg轉(zhuǎn)換或未轉(zhuǎn)換，在12、24及48周隨訪中，兩種試劑定量檢測HBV RNA結(jié)果均呈現(xiàn)較強(qiáng)的正相關(guān)性，提示兩種試劑檢測結(jié)果可能均反映了cccDNA的轉(zhuǎn)錄[11,18-20]。第三，與X試劑檢測結(jié)果相比，S試劑檢測結(jié)果HBV RNA讀數(shù)較低，且二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，提示S檢測試劑靈敏度可能較高或線性范圍更廣，但目前仍然缺乏HBV RNA檢測試劑標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行直接比較，仍需要進(jìn)一步的深入研究。

HBeAg陽性CHB患者長期NUC抗病毒治療過程中，Bland-Altman法一致性分析結(jié)果提示，兩種試劑對(duì)HBV RNA定量檢測結(jié)果中96.18%的差異位于平均差±1.96標(biāo)準(zhǔn)差之間，97.71%(128/131)樣本之間的差異<2 log。造成兩種方法檢測結(jié)果之間的差異，可能的原因包括核酸的提取，洗脫液量、模板量、PCR反應(yīng)體積及擴(kuò)增靶區(qū)的不同等。這也提示了臨床檢驗(yàn)中需要標(biāo)準(zhǔn)化的檢測流程及質(zhì)控體系。除此之外，HBeAg陰性患者及使用干擾素抗病毒治療過程中，兩種試劑檢測結(jié)果的一致性仍有待于進(jìn)一步的研究。

綜上所述，在臨床HBeAg陽性CHB患者血清中，S和X檢測試劑實(shí)時(shí)HBV RNA定量檢測結(jié)果之間具有很強(qiáng)的相關(guān)性和良好的一致性，但不同實(shí)驗(yàn)室檢測流程的標(biāo)準(zhǔn)化仍需要進(jìn)一步改進(jìn)。

倫理學(xué)聲明：本研究經(jīng)由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批號(hào)：京佑科倫字〔2019〕056號(hào)。所納入患者均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：王揚(yáng)負(fù)責(zé)整理、統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并撰寫初稿；廖昊、鄧中平給予試驗(yàn)平臺(tái)及負(fù)責(zé)試驗(yàn)操作；卞丹丹、任艷及蔣瑩瑩負(fù)責(zé)臨床數(shù)據(jù)及血清樣本的收集、整理及分析；劉霜、陳煜負(fù)責(zé)管理項(xiàng)目實(shí)施；魯鳳民、段鐘平、鄭素軍負(fù)責(zé)研究設(shè)計(jì)，嚴(yán)格審閱及修訂稿件并批準(zhǔn)最終版本投稿。所有作者審閱稿件并參與稿件的修訂。