丹參酮ⅡA聯合阿托伐他汀對大鼠動脈粥樣硬化的治療作用研究

葉澤森,周里巖,黃光業,薛照蕓,劉培慶,陳健文

(中山大學藥學院,中國廣東 廣州 510006)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是心腦血管系統中最常見的疾病,由AS繼發導致的重要器官缺血性損傷綜合征(如心肌梗死和中風等),是威脅人類健康和導致死亡的主要原因[1]。盡管近20年來治療手段不斷改善,AS依舊有著高發病率和死亡率。雖然在許多發達國家心腦血管疾病的病死率稍有下降,但AS卻在發展中國家以驚人的速度增長著[2～3]。因此,預防和治療AS依舊是心腦血管領域一個嚴峻的挑戰。

阿托伐他汀作為3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑,能夠降低膽固醇的生物合成,是目前AS的一線治療藥物之一[4]。除了降低膽固醇作用之外,阿托伐他汀已被證明具有免疫調節、改善內皮細胞功能、抗炎、抗氧化等藥理作用[5]。盡管阿托伐他汀已用作治療AS的降脂藥物,但其仍存在肌病、橫紋肌溶解、肝毒性等嚴重不良反應,一定程度上影響患者的依從性[6]。另外,在許多嚴重血脂異常的AS患者中,阿托伐他汀作為單藥的治療效果不佳[4]。鑒于AS的復雜病因,在一些臨床試驗中,阿托伐他汀通常與非他汀類降脂藥物、抗高壓藥物、抗糖尿病藥物、抗血栓藥物聯合治療AS[7～10]。然而,以往的研究表明,煙酸與阿托伐他汀的聯合用藥對AS斑塊消退的附加作用有限[11]。此外,貝特類藥物的副作用與PCSK9抗體(降低血液中低密度膽固醇水平)的高成本,限制了它們與阿托伐他汀在臨床上的廣泛聯合應用[12～13]。因此,開發新的抗AS的藥物組合顯得尤為重要。

丹參酮ⅡA(tanshinone ⅡA,TS ⅡA)是唇形科植物丹參中提取出的活性成分,目前臨床上已用于治療冠心病[14]。一項薈萃分析顯示,丹參酮ⅡA聯合西藥(如阿司匹林)能更好地治療不穩定性心絞痛[15]。近年研究表明,丹參酮ⅡA在體內外AS模型展現出抗炎、免疫調節和斑塊穩定等作用[16]。血脂異常被認為是AS進展的危險因素,調節血脂是治療AS的重要策略[17]。以往的實驗結果表明,丹參酮ⅡA不影響脂質代謝,但與阿托伐他汀聯用能夠減少和穩定ApoE-/-小鼠AS斑塊[18]。然而,考慮到ApoE蛋白的多重功能,使用AS ApoE-/-小鼠模型存在一定的局限性[19]。因此,本研究通過高脂飼料聯合維生素D3建立AS大鼠模型,檢測血脂等生化指標,觀察組織病理學變化,研究丹參酮ⅡA聯合阿托伐他汀治療AS的協同作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF(specific pathogen free)級雄性SD大鼠(180～200 g)由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供,動物生產合格證編號:SCXK(粵)2013-0034。實驗動物購回后飼養于中山大學北校區動物實驗中心SPF級環境,動物使用許可證編號:SYXK(粵)2016-0112,溫度22～24℃,相對濕度50%～70%。

1.1.2 實驗試劑

受試藥物丹參酮ⅡA由中山大學藥學院藥物化學研究室古練權教授提供;阿托伐他汀鈣(立普妥,LipitorTM)源自輝瑞制藥有限公司(美國);0.9%氯化鈉注射液源自四川科倫藥業股份有限公司;維生素D3注射液購自上海通用藥業股份有限公司;羧甲基纖維素鈉源自天津市大茂化學試劑廠;甲醛、NaCl、NaHCO3、KCl、KH2PO4、MgSO4、CaCl2和葡萄糖源自廣州化學試劑廠;OCT包埋劑購自Sakura公司(美國);防脫載玻片和蘇木精-伊紅染色試劑盒(H&E試劑盒)購自武漢博士德生物工程有限公司;普通飼料(小麥粉20%、生豆餅10%、玉米粉20%、標準粉36%、食鹽4%、蛋殼粉5%、雞蛋5%)和高脂飼料(普通飼料82.3%、煉豬油10%、糖5%、膽固醇2%、膽鹽0.5%、丙基硫脲嘧啶0.2%)均由廣東省實驗動物中心按標準配方配制。

1.1.3 實驗儀器

Pl303電子天平(瑞士梅特勒-托利多集團);LDZ5-2型離心機(北京醫用離心機廠);CM1905型冰凍切片機(德國LEICA公司);全自動生化分析儀(日本日立高興技術公司);IX71-F22FL/PH型倒置顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社);DV500顯微數碼照相系統(重慶奧特光學儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組、造模及給藥

SPF級雄性SD大鼠80只,體重180～200 g,適應性喂養1周后隨機取10只作為正常對照組,腹腔注射生理鹽水2 mL/kg,連續注射4 d,實驗期間給予普通飼料喂養。其余70只大鼠連續4 d腹腔注射300 000 IU/(kg·d)維生素D3,實驗期間給予高脂飼料喂養,并按照體重均勻分成7組:模型組、丹參酮ⅡA低劑量(7 mg/kg)組、丹參酮ⅡA中劑量(21 mg/kg)組、丹參酮ⅡA高劑量(63 mg/kg)組、阿托伐他汀(7 mg/kg)組、丹參酮ⅡA低劑量(7 mg/kg)+阿托伐他汀(7 mg/kg)組、丹參酮ⅡA中劑量(21 mg/kg)+阿托伐他汀(7 mg/kg)組,每組10只。丹參酮ⅡA和阿托伐他汀用0.5%的羧甲基纖維素鈉配制成混懸液,現配現用。各用藥組為預防性給藥,在喂養高脂飼料的同時每天灌胃給藥1次,給藥體積為10 mL/(kg·d),連續16周,正常對照組和模型組給予等體積的0.5%的羧甲基纖維素鈉。

1.2.2 一般情況觀察

每天仔細觀察各組動物的一般情況,包括:毛色、狀態、活動、飲食情況。每周稱量并記錄大鼠體重1次。

1.2.3 血脂水平及生化指標的檢測

第16周末,禁食12 h,用3%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠,仰臥位固定于解剖臺,剪開腹部皮膚,撥開皮膚與腹腔內組織,暴露下腔靜脈。自下腔靜脈取血5 mL,收集于5 mL采血管(未包被抗凝劑),在室溫下靜置待血清析出后,2 600 r/min離心15 min分離血清,分裝于1.5 mL EP管中,置于-80℃保存待測。于全自動生化分析儀上檢測所得血清中總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triacylglycerol,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(highdensity lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)的濃度,并按照如下公式計算動脈硬化指數(atherosclerosis index,AI):動脈硬化指數=(總膽固醇濃度-高密度脂蛋白膽固醇濃度)/高密度脂蛋白膽固醇濃度。

1.2.4 主動脈組織病理學檢查

沿胸主動脈往下,分離腹主動脈直至髂動脈分支處,小心去除血管周圍的結締組織及脂肪,用濾紙小心吸干殘留血液,置于凍存管中,迅速投入液氮后轉入-80℃冰箱保存。將組織進行冰凍切片,并進行蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色,最后在光學顯微鏡下鏡檢(400×)。采用XnView軟件計算血管內膜厚度與血管厚度的比值。

1.2.5 統計分析

運用GraphPad Prism軟件繪制圖表,采用SPSS統計軟件對實驗數據進行分析處理,結果用平均值±標準誤(±sx)表示。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行各組間數據分析,P＜0.05為差異具有顯著性。

2 結果

2.1 丹參酮ⅡA聯合阿托伐他汀對AS大鼠體重和一般狀態的影響

造模后連續16周觀察各組大鼠一般情況,結果顯示:與正常對照組相比,第1～3周,模型組體重未見明顯差異(P＞0.05),第4周開始,模型組大鼠體重顯著下降(P＜0.05);觀察期間,各給藥組體重較模型組沒有明顯變化(P＞0.05)(圖1)。此外,正常對照組大鼠毛色光亮,行為活躍;模型組大鼠從第4周開始,毛色偏黃,行動遲緩;模型組與各給藥組之間未見明顯差異。

圖1 各組大鼠每周體重的變化情況aP＜0.05,表示在同一時間點,正常對照組與模型組相比,差異具有統計學意義。Fig.1 The changes of weekly body weight of rats in each groupameans statistically significant(P＜0.05),control group vs.model group at the same time point.

2.2 丹參酮ⅡA聯合阿托伐他汀對AS大鼠血脂水平及AI的影響

為了確定受試藥的降脂功能,我們檢測了造模16周大鼠的血脂四項,包括TC、TG、LDL-C、HDL-C。由圖2可知,與模型組大鼠相比,阿托伐他汀能明顯降低血清中TC、LDL-C含量(P＜0.01);丹參酮ⅡA雖能輕度降低大鼠血清TC、TG和LDL-C含量,升高HDL-C含量,但差異不顯著(P＞0.05);聯合用藥組均能大幅降低血清中TC、TG、LDL-C含量(P＜0.01),且效果有優于阿托伐他汀組的趨勢,其中,中劑量的聯合用藥組降低血清中TC、TG、LDL-C的幅度最大。進一步分析各組大鼠的AI值,結果顯示:造模后的大鼠AI值顯著增高(P＜0.01)(圖3)。與模型組相比,丹參酮ⅡA低、高劑量組雖能降低AI,但未形成顯著性差異(P＞0.05);阿托伐他汀和聯合用藥組均能顯著降低AI(P＜0.01),且聯合用藥組的AI均較阿托伐他汀組低(圖3)。以上信息提示,丹參酮ⅡA具有增強阿托伐他汀降低血液中TC、TG、LDL-C及AI的功能。

圖2 丹參酮ⅡA聯合阿托伐他汀對AS大鼠血清TC、TG、HDL-C及LDL-C的影響##:P＜0.01 vs.正常對照組;*:P＜0.05,**:P＜0.01 vs.模型組。Fig.2 Effects of tanshinone ⅡA combined with atorvastatin on serum TC,TG,HDL-C and LDL-C concentrations in AS rats##:P＜0.01,compared with control group;*:P＜0.05,**:P＜0.01,compared with model group.

圖3 丹參酮ⅡA聯合阿托伐他汀對大鼠AI指數的影響##:P＜0.01 vs.正常對照組;*:P＜0.05,**:P＜0.01 vs.模型組。Fig.3 Effects of tanshinone ⅡA combined with atorvastatin on AI in rats##:P＜0.01,compared with control group;*:P＜0.05,**:P＜0.01,compared with model group.

2.3 丹參酮ⅡA聯合阿托伐他汀對AS大鼠主動脈結構的影響

盡管血脂水平是評估AS模型是否成功的首要因素,但是最終判斷還是基于病理形態和功能改變。我們通過光學顯微鏡檢查了各組大鼠腹主動脈組織的病理形態,結果顯示:正常對照組血管內膜為單層扁平狀內皮細胞,完整、均勻且平坦,血管中膜平滑肌細胞排列整齊、緊密、層次清晰。與正常對照組相比,模型組明顯可見內膜大面積增厚,血管壁向官腔內突出,內有泡沫細胞、壞死組織和膽固醇結晶等物質,鈣化和纖維化明顯,同時血管中膜平滑肌細胞增生、排列紊亂,并向血管內膜遷移,形成早期AS病變。與模型組相比,各給藥組均能夠顯著抑制血管內膜增厚,減少血管內膜下脂質沉積,減輕血管鈣化程度,減少平滑肌纖維斷裂并改善其排列紊亂;其中,聯合用藥組內皮細胞少量缺失,血管內膜增厚不明顯,血管中膜平滑肌細胞輕度增生,排列較為整齊,病理改變明顯輕于其他各給藥組及模型組。各組主動脈組織病理形態證實,維生素D3合并高脂飼料喂養成功建立大鼠AS模型,丹參酮ⅡA與阿托伐他汀聯合用藥對大鼠AS形成有明顯的抑制作用,且聯合用藥優于單獨用藥。

圖4 各組大鼠腹主動脈病理組織學切片代表照片(HE染色,400×)A.正常對照組;B.模型組;C.丹參酮ⅡA低劑量組;D.丹參酮ⅡA中劑量組;E.丹參酮ⅡA高劑量組;F.阿托伐他汀組;G.丹參酮ⅡA低劑量+阿托伐他汀組;H.丹參酮ⅡA中劑量+阿托伐他汀組。Fig.4 Pathological sections of abdominal aorta of rats in each group(HE,400×)A.Control group;B.Model group;C.Low-dose tanshinone ⅡA group;D.Medium-dose tanshinone ⅡA group;E.High-dose tanshinone ⅡA group;F.Atorvastatin group;G.Low-dose tanshinone ⅡA+atorvastatin group;H.Medium-dose tanshinone ⅡA+atorvastatin group.

為了進一步探究受試藥對AS大鼠腹主動脈的保護作用,我們計算了血管內膜厚度與血管厚度的比值。結果如圖5所示,模型組血管內膜厚度與血管厚度的比值明顯增大,說明模型組血管內膜增厚嚴重;各給藥組均能降低這一比值,其中丹參酮ⅡA高劑量、阿托伐他汀及聯合用藥組均能顯著減輕血管內膜增厚(P＜0.01);兩聯合用藥組較單用丹參酮ⅡA低、中劑量組顯著降低血管內膜厚度與血管厚度的比值(P＜0.01),且中劑量的聯合用藥組較丹參酮ⅡA高劑量及阿托伐他汀組作用更顯著(P＜0.01)。這提示,相比丹參酮ⅡA和阿托伐他汀單獨用藥,聯合用藥能更有效地抑制血管內膜增厚,抗AS作用更強。

圖5 丹參酮ⅡA聯合阿托伐他汀對AS大鼠血管內膜厚度與血管厚度比值的影響##:P＜0.01 vs.正常對照組;*:P＜0.05,**:P＜0.01 vs.模型組。Fig.5 Effects of tanshinone ⅡA combined with atorvastatin on vascular intima thickness/vascular thickness ratio in AS rats##:P＜0.01,compared with control group;*:P＜0.05,**:P＜0.01,compared with model group.

3 討論

阿托伐他汀是臨床上治療AS常用的口服降脂藥物。然而,阿托伐他汀導致的糖代謝異常、肝毒性以及肌肉相關副作用,限制了其臨床上的廣泛使用[20]。此外,阿托伐他汀作為單藥治療嚴重高血脂的AS患者時,并不能達到理想的降脂效果[4]。AS的發展受多種復雜機制的調節,聯合治療可能更有效。近年來,在一些臨床試驗中,阿托伐他汀常與其他藥物聯用治療AS,其中包括:1)非他汀類的降脂藥物,如貝特類、煙酸、依折麥布、PCSK9抑制劑[4];2)抗高血壓藥物,如培哚普利、氨氯地平[8];3)抗糖尿病藥物,如吡格列酮[9];4)抗血小板藥物,如阿司匹林[10]。但相關報道顯示,阿托伐他汀與非他汀類藥物的聯合降脂療法存在治療不全面、潛在的副作用以及成本效益不佳等問題[11～13,21]。丹參酮ⅡA作為天然心臟保護劑,具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集及免疫調節等藥理作用[22]。本研究發現,丹參酮ⅡA聯合阿托伐他汀較單獨用丹參酮ⅡA或阿托他汀能夠更加有效降低TC、TG和LDL-C水平,并進一步改善AS大鼠主動脈病變。我們的研究結果支持丹參酮ⅡA聯合阿托伐他汀治療AS,這可能為心腦血管疾病的治療提供了一種新的策略。

脂質代謝紊亂是促進AS發生與發展的重要原因,過量的膽固醇攝入導致動脈內脂質積聚和斑塊形成[23]。本研究通過連續4 d腹腔注射維生素D3并配合高脂飼料喂養,建立AS大鼠模型。造模后的第4周,模型組大鼠體重顯著低于正常對照組(P＜0.05),而各給藥組大鼠的體重較模型組無明顯變化(圖1)。既往的類似研究也發現,維生素D3聯合高脂飼料制備的AS大鼠體重下降明顯[24～25]。這可能是由于注射大劑量的鈣誘導劑維生素D3對大鼠機體損傷較大,使得體重增長減緩[26]。在本研究中,造模16周的模型組大鼠血清中TC、TG和LDL-C水平明顯增加(P＜0.01),而丹參酮ⅡA各劑量組對這些指標無明顯影響(圖2),這與以往的研究[27]相一致;阿托伐他汀能夠顯著降低血清中TC、LDL-C水平(P＜0.01)(圖2),這符合阿托伐他汀抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶的藥理特性[28]。此外,本研究發現,低、中劑量的丹參酮ⅡA聯合阿托伐他汀能夠更有效地降低血清TC和LDL-C水平,并且明顯降低血清TG水平(P＜0.01)(圖2),這提示丹參酮ⅡA能增強阿托伐他汀的降脂功能。AI指數是國際醫學界制定的一個衡量動脈硬化程度的指標[29]。文中實驗結果顯示,丹參酮ⅡA單用雖未對AI產生顯著影響,但與阿托伐他汀聯用后能增強阿托伐他汀的作用(圖3)。相關臨床試驗也表明,丹參酮ⅡA輔助治療相較單獨使用阿托伐他汀,能夠進一步降低冠心病患者血清中超敏C反應蛋白(hypersensitive C-reactive protein,hs-CRP)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)和單核細胞趨化因子-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)等炎癥標記物的水平,調節血脂水平[30～31]。

越來越多的研究表明,AS是一種復雜的慢性血管疾病,其主要病理特征為動脈內膜脂質沉積、內膜局灶性纖維化增厚和AS斑塊形成[32～33]。AS病變始于血管內皮細胞的損傷,這會使血管內膜通透性升高,大量單核細胞黏附在血管內膜,并轉化為巨噬細胞,進而吞噬脂蛋白形成泡沫細胞[34]。這些泡沫細胞死亡后,其脂質填充物進入壞死核心,形成脂質條紋,并且積累從血管中膜遷移過來的平滑肌細胞。平滑肌細胞通過分泌纖維物質促進斑塊體積增長,同時新的單核細胞不斷向損傷的血管壁遷移,并伴隨著細胞增殖、細胞外基質產生和積累的脂質填充物,最終導致損傷向外膜蔓延直至臨界點[35]。我們通過觀察各組大鼠腹主動脈的組織病理學變化發現,模型組血管內膜嚴重增厚,平滑肌細胞增生、排列紊亂,血管壁形成長條斑塊,鈣化、纖維化嚴重;各給藥組均能不同程度地抑制血管內膜增厚,減少血管內膜下脂質沉積,減輕血管鈣化程度,減少平滑肌纖維斷裂并改善其排列紊亂(圖4)。進一步的血管內膜厚度與血管厚度的比值分析結果顯示,中劑量的聯合用藥組比丹參酮ⅡA高劑量和阿托伐他汀組更明顯地抑制血管內膜增生(圖5),這說明,聯合用藥在降低用藥劑量的同時,也增強了治療效果,可謂一舉兩得。

當然,本研究也存在一些不足之處。盡管實驗結果初步表明,丹參酮ⅡA聯合阿托伐他汀在降血脂和抗AS病變方面明顯優于單一用藥,但丹參酮ⅡA與阿托伐他汀發揮協同作用的具體機制尚不清楚。丹參酮ⅡA的抗氧化和抗炎作用可能是其治療AS的潛在機制之一。Li等[36]通過細胞共培養模型發現,丹參酮ⅡA能夠降低AS相關炎癥細胞因子,這與其抑制核因子活化B細胞κ輕鏈增強子(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cell,NF-κB)信號通路密切相關。Yang等[37]在腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)誘導大鼠內皮祖細胞的研究中發現,丹參酮ⅡA可抑制NF-κB信號通路傳導,降低黏附因子的表達。Chen等[38]研究表明,丹參酮ⅡA可通過抑制Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)/髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)/NF-κB信號通路,發揮抗炎和調節免疫反應的作用,以減輕ApoE-/-小鼠斑塊病變。另有研究報道,在AS大鼠、兔及ApoE-/-缺陷小鼠中,丹參酮ⅡA可降低脂質過氧化物水平,并通過多個靶點,如細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、NF-κB、過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)和 microRNA,抑制AS[39]。泡沫細胞的形成是AS病變的初始和關鍵步驟[40]。Liu等[41]發現,丹參酮ⅡA通過激活抗氧化信號通路核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)/血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1),抑制巨噬細胞對脂質的攝取,減少泡沫細胞的形成。我們下一步計劃在體內外AS模型中,深入探討丹參酮ⅡA與阿托伐他汀在激活抗氧化通路Nrf2/HO-1和抑制NF-κB介導的炎癥通路中的協同作用。此外,丹參酮ⅡA與阿托伐他汀聯用的最佳劑量尚未明確,我們仍需后續的藥代動力學實驗來確定最佳聯用劑量。

總的來說,本研究證明丹參酮ⅡA聯合阿托伐他汀具有更強的降脂作用,能夠減緩AS的發生與發展。本研究為未來臨床上使用丹參酮ⅡA聯合阿托伐他汀治療AS提供了理論基礎,但是這種聯合療法改善AS的確切機制未知,需要進一步的研究來揭示其分子機制。