木犀草素通過(guò)抑制URAT1與調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1通路改善尿酸誘導(dǎo)的腎臟損傷

嚴(yán)采馨,田錦鴻,李 璐 ,龐建新,吳 婷

(南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,中國(guó)廣東 廣州 510515)

尿酸(uric acid,UA)是人體嘌呤代謝的最終產(chǎn)物,其70%通過(guò)腎臟排出,因而腎臟被認(rèn)為是循環(huán)尿酸的重要調(diào)節(jié)器[1]。持續(xù)的尿酸水平升高容易引發(fā)腎小管損傷、間質(zhì)纖維化、腎小球硬化和尿酸鹽結(jié)晶沉積,最終導(dǎo)致高尿酸性腎病[2～3],嚴(yán)重影響疾病預(yù)后和患者的生活質(zhì)量。

尿酸性腎病的治療關(guān)鍵在于控制高尿酸血癥與保護(hù)腎功能[4]。目前,臨床上用于治療尿酸性腎病的藥物主要包括:尿酸合成抑制劑(如別嘌呤醇)與促進(jìn)尿酸排泄的藥物(如苯溴馬隆)[5]。上述藥物雖能明顯降低血尿酸水平,但別嘌呤醇易引起過(guò)敏反應(yīng),苯溴馬隆易引起腎臟病變,因此,研發(fā)既能降尿酸又具有腎臟保護(hù)作用的藥物對(duì)防治尿酸性腎病顯得尤為迫切[6]。

尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(uric acid transporter 1,URAT1)主要表達(dá)在腎臟,是維持尿酸穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)[7～8]。目前,幾乎所有的促尿酸排泄藥都集中在URAT1靶點(diǎn),包括苯溴馬隆,它們通過(guò)將多余的尿酸從血液中轉(zhuǎn)運(yùn)至腎小管上皮細(xì)胞內(nèi),達(dá)到降低血尿酸水平的作用。

核因子E2-相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是機(jī)體內(nèi)普遍存在的一種核轉(zhuǎn)錄因子。研究顯示,Nrf2可誘導(dǎo)抗氧化酶轉(zhuǎn)錄與表達(dá),從而對(duì)機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)起到重要的調(diào)控作用[9～10]。血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)是Nrf2的下游基因,氧化應(yīng)激狀態(tài)下Nrf2被激活入核,啟動(dòng)HO-1轉(zhuǎn)錄表達(dá),從而降解血紅素、一氧化氮等,抑制氧化應(yīng)激損傷[11～12]。

近年來(lái),中草藥在治療尿酸性腎病過(guò)程中已取得較好療效,且中草藥具有副作用小、增效減毒的優(yōu)勢(shì)[13]。木犀草素(3,4,5,7-四羥基黃酮)是一種天然黃酮類物質(zhì),存在于多種植物性食物和中草藥中[14]。有研究表明,其具有抗氧化應(yīng)激[15]、抗炎[16]、降尿酸[5,17]等作用。針對(duì)其降尿酸的研究發(fā)現(xiàn),木犀草素在體內(nèi)外均可通過(guò)抑制黃嘌呤氧化酶減少尿酸合成[17],在體內(nèi)可通過(guò)上調(diào)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(ATP binding cassette subfamily G member 2,ABCG2)促進(jìn)尿酸排泄[5],從而使腎臟免受高尿酸誘導(dǎo)的損傷。然而,木犀草素對(duì)URAT1的活性及表達(dá)的影響,以及其對(duì)高尿酸誘導(dǎo)的腎臟纖維化的影響,目前尚無(wú)研究報(bào)道。本文旨在探索木犀草素對(duì)URAT1的作用及其在高尿酸誘導(dǎo)的腎臟纖維化模型中的作用,為進(jìn)一步闡明木犀草素降尿酸及其腎臟保護(hù)作用的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

木犀草素(純度≥98%)購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司。氧嗪酸鉀(potassium oxazine,PO)、腺嘌呤(adenine,Ad)購(gòu)自阿拉丁試劑(上海)有限公司。肌酐(creatinine,CR)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和總谷胱甘肽(glutathione,GSH)測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。尿酸測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)BioAssay Systems公司。四甲基偶氮唑鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]購(gòu)自北京索萊寶有限公司。兔源URAT1一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。GAPDH抗體、兔源二抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠腎小管上皮細(xì)胞(mRTEC)與HEK293T細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存,分別用含10%胎牛血清的DMEM-F12、DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)于 5% CO2、37 ℃的恒溫箱中,待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合度,進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與14C尿酸攝取實(shí)驗(yàn)

當(dāng)HEK293T細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合度時(shí),使用Lipofectamine 3000試劑(Invitrogen公司,美國(guó))轉(zhuǎn)染表達(dá)URAT1蛋白的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24 h后,將其用于14C尿酸攝取實(shí)驗(yàn)。尿酸攝取實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,棄去培養(yǎng)基,然后將細(xì)胞與尿酸吸收緩沖液(含有125 mmol/L葡萄糖酸鈉、4.8 mmol/L葡萄糖酸鉀、1.2 mmol/L磷酸二氫鉀、1.2 mmol/L硫酸鎂、1.3 mmol/L葡萄糖酸鈣和5.6 mmol/L葡萄糖)一起預(yù)孵育15 min,細(xì)胞開(kāi)始攝取尿酸。具體的實(shí)驗(yàn)步驟參考課題組前期發(fā)表的文章[18]。

1.4 細(xì)胞活力測(cè)定

采用MTT法測(cè)定木犀草素對(duì)尿酸誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的影響。取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞,以每孔4×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板。評(píng)價(jià)木犀草素、尿酸單獨(dú)處理對(duì)細(xì)胞活力的影響時(shí),木犀草素有0 μmol/L、2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L 7 個(gè)組,尿酸有 0 mg/dL、5 mg/dL、10 mg/dL、15 mg/dL、20 mg/dL 5 個(gè)組,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。評(píng)價(jià)木犀草素對(duì)尿酸導(dǎo)致的細(xì)胞損傷的保護(hù)作用時(shí),將細(xì)胞分為5組:正常對(duì)照組(normal control,NC)、高尿酸處理組、低劑量木犀草素(2.5 μmol/L)+尿酸組、高劑量木犀草素(5 μmol/L)+尿酸組、陽(yáng)性藥 lesinurad(10 μmol/L)+尿酸組,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后,每孔加入5 mg/mL的MTT,37℃孵育4 h后棄去上清液,按每孔150 μL加入二甲基亞砜,低速搖床振蕩10 min,用酶標(biāo)儀在570 nm處檢測(cè)各孔吸光度值,計(jì)算各組細(xì)胞存活率。細(xì)胞活力=(給藥組OD值-對(duì)照組OD值)/對(duì)照組OD值。

1.5 尿酸性腎病動(dòng)物模型建立、分組與給藥

參考課題組前期已發(fā)表文章中的方法[4]并做適當(dāng)調(diào)整。選取24只雄性昆明小鼠(購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,體重20 g±2 g),適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后,隨機(jī)分為4組(n=6),分別為溶劑對(duì)照組(NC)、尿酸性腎病模型組(HN)、木犀草素低劑量組(10 mg/kg)、木犀草素高劑量組(20 mg/kg)。造模前,木犀草素組小鼠連續(xù)5 d腹腔注射木犀草素溶液,其余組小鼠注射等體積溶劑。第6天開(kāi)始,除溶劑對(duì)照組外的小鼠每隔1 d于上午8:30腹腔注射氧嗪酸鉀(PO,350 mg/kg)并灌胃腺嘌呤(Ad,70 mg/kg),持續(xù)兩周,制備尿酸性腎病模型,具體實(shí)驗(yàn)分組見(jiàn)表1。每次造模后1 h,于上午9:30給木犀草素處理組小鼠腹腔注射木犀草素。NC組小鼠接受等體積溶劑,即0.5%羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose,CMC-Na)。最后一次給藥后,腹腔注射5%水合氯醛麻醉小鼠,采集血清,用于測(cè)定血清尿酸、CR、BUN、MDA、SOD和GSH水平。采樣結(jié)束后,脫頸處死動(dòng)物并于冰上分離腎臟組織,記錄體重和腎臟質(zhì)量,計(jì)算腎臟指數(shù),腎臟指數(shù)=腎臟質(zhì)量(mg)/體重(g)×100。將其中一個(gè)腎置于4%多聚甲醛溶液中固定,用于進(jìn)行H&E染色與Masson染色;另一個(gè)腎置于2 mL離心管中,保存于-80℃冰箱,用于測(cè)定mRNA與蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

表1 木犀草素緩解尿酸性腎損傷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的分組與給藥信息Table 1 The grouping and drug administration for the study of luteolin on the kidney injury induced by uric acid

1.6 生化指標(biāo)檢測(cè)

按試劑盒說(shuō)明書方法檢測(cè)血清尿酸、CR、BUN、MDA、SOD和GSH水平。

1.7 腎臟H&E染色與Masson染色

將在4%多聚甲醛中固定好的小鼠腎臟組織進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋和切片(4 μm),對(duì)切片進(jìn)行H&E染色與Masson染色[4],觀察腎臟病理改變。使用光學(xué)顯微鏡以×200的放大倍數(shù)觀察染色切片。通過(guò)Image-Pro Plus 6.0軟件分析每個(gè)切片的膠原沉積區(qū)域(整個(gè)皮質(zhì)區(qū)域的藍(lán)色區(qū)域)并評(píng)分。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

根據(jù)RNA提取試劑盒(成都福際生物技術(shù)有限公司)操作說(shuō)明提取腎組織RNA,測(cè)定腎臟URAT1、TGF-β、α-SMA、E-cadherin、Nrf2、HO-1 的mRNA表達(dá)水平,引物序列見(jiàn)表2。首先,利用PrimeScript RT試劑盒(日本Takara公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后,按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRTPCR)試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司)操作說(shuō)明測(cè)定腎臟mRNA水平。利用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量,其中內(nèi)參基因?yàn)棣?actin。

表2 qRT-PCR引物序列Table 2 Primer sequences used in quantitative real-time PCR analysis

1.9 Western-blot

提取腎組織蛋白質(zhì),檢測(cè)腎臟URAT1、Nrf2和HO-1的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。具體方法如下:用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,每組加入5×上樣緩沖液煮10 min。蛋白質(zhì)上樣,進(jìn)行凝膠電泳。轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉2 h;孵育URAT1一抗(1∶1 000)和GAPDH一抗(1∶5 000)過(guò)夜,TBST洗膜3次,每次10 min;二抗(1∶5 000)孵育1 h,TBST洗膜6次,每次5 min;用ECL顯色液曝光,掃描后使用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 木犀草素體外抑制URAT1轉(zhuǎn)運(yùn)尿酸

結(jié)果如圖1所示,木犀草素劑量依賴性地抑制URAT1的尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)活性,IC50值為 23.42 μmol/L,與陽(yáng)性藥lesinurad活性相當(dāng)(IC50為19.12 μmol/L)。

圖1 木犀草素與lesinurad劑量依賴性地抑制URAT1轉(zhuǎn)運(yùn)14C尿酸(A)木犀草素對(duì)URAT1的劑量依賴性抑制作用;(B)Lesinurad對(duì)URAT1的劑量依賴性抑制作用。Fig.1 Effects of luteolin and lesinurad on URAT1-meidated14C-urate transport(A)Dose-dependent inhibitory effect of luteolin on URAT1;(B)Dose-dependent inhibitory effect of lesinurad on URAT1.

2.2 木犀草素改善高尿酸誘導(dǎo)的細(xì)胞活力減低

從圖2A～B的結(jié)果可知,木犀草素在低于10 μmol/L時(shí)并不會(huì)引起mRTEC細(xì)胞活力降低,故后續(xù)選擇2.5μmol/L和5 μmol/L兩個(gè)濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn);隨著尿酸濃度的增加,細(xì)胞活力逐漸減低,考慮到20 mg/dL尿酸引起的細(xì)胞損傷過(guò)于嚴(yán)重,而10 mg/dL尿酸引起的細(xì)胞損傷程度較15 mg/dL輕,故后續(xù)選擇15 mg/dL尿酸進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。圖2C的結(jié)果顯示,與單獨(dú)使用尿酸處理組的細(xì)胞相比,2.5 μmol/L和5 μmol/L木犀草素有效地改善了由高尿酸誘發(fā)的細(xì)胞活力降低,且其保護(hù)作用略優(yōu)于陽(yáng)性藥物lesinurad(10 μmol/L)。

圖2 木犀草素對(duì)高尿酸誘導(dǎo)的細(xì)胞活力減低的影響(A)木犀草素單獨(dú)處理對(duì)mRTEC細(xì)胞活力的影響;(B)尿酸單獨(dú)處理對(duì)mRTEC細(xì)胞活力的影響;(C)木犀草素與lesinurad對(duì)尿酸誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。###:P＜0.001 vs.NC組;圖A與圖B中,*:P＜0.05,**:P＜0.01,***:P＜0.001 vs.未加藥處理組;圖C中,***:P＜0.001 vs.UA組。Fig.2 Effect of luteolin on decreased viability of mRTEC cells induced by high UA levels(A)Viability of mRTEC cells treated with luteolin;(B)Viability of mRTEC cells treated with UA;(C)Protective effects of luteolin and lesinurad on UA-induced mRTEC cell injury.###:P＜0.001 vs.the NC group;*:P＜0.05,**:P＜0.01,***:P＜0.001 vs.the group without drug treatment in Figs.2A and 2B;***:P＜0.001 vs.the UA-treated group in Fig.2C.

2.3 木犀草素降低模型小鼠血清尿酸、CR與BUN水平

圖3結(jié)果顯示,與NC組小鼠相比,HN組小鼠血清尿酸、CR、BUN水平明顯升高,而高、低劑量木犀草素能顯著下調(diào)上述異常指標(biāo)。H&E染色結(jié)果也明確顯示,木犀草素能明顯改善高尿酸引起的腎小管擴(kuò)張和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖4A)。

圖3 木犀草素對(duì)HN小鼠血清尿酸、CR與BUN水平的影響(A)血清尿酸水平;(B)血清肌酐水平;(C)血清尿素氮水平。##:P＜0.01,###:P＜0.001 vs.NC組;*:P＜0.05,**:P＜0.01 vs.HN組;ns表示與HN組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Fig.3 Effects of luteolin on serum UA,CR and BUN levels in mice with HN(A)Serum UA level;(B)Serum CR level;(C)Serum BUN level.##:P＜0.01,###:P＜0.001 vs.the NC group;*:P＜0.05,**:P＜0.01 vs.the HN group;ns represents no statistical difference compared with the model group.

2.4 木犀草素改善尿酸性腎病模型小鼠腎臟纖維化

從圖4可知,HN組小鼠腎臟出現(xiàn)明顯的腎間質(zhì)纖維化(圖4B),其纖維化評(píng)分較NC組具有顯著性差異(圖4C,P＜0.001);與HN組小鼠相比,木犀草素處理組腎臟腎間質(zhì)纖維化水平顯著降低(圖4C,P＜0.001)。我們還檢測(cè)了腎臟中纖維化因子TGF-β、α-SMA和E-cadherin的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果如圖4D～F所示,木犀草素可逆轉(zhuǎn)高尿酸誘導(dǎo)的TGF-β和α-SMA上調(diào)與E-cadherin下調(diào)。上述結(jié)果提示,木犀草素可能是防治尿酸性腎病過(guò)程中腎纖維化的有效候選化合物。

圖4 木犀草素對(duì)HN小鼠腎臟病理變化與纖維化的影響(A)各組腎臟H&E染色結(jié)果,黑色箭頭表示腎小管擴(kuò)張、炎性細(xì)胞浸潤(rùn);(B)各組腎臟Masson染色結(jié)果;(C)纖維化評(píng)分;(D)腎臟TGF-β基因的相對(duì)表達(dá)水平;(E)腎臟α-SMA基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平;(F)腎臟E-cadherin基因的相對(duì)表達(dá)水平。#:P＜0.05,##:P＜0.01,###:P＜0.001 vs.NC 組;**:P＜0.01,***:P＜0.001 vs.HN 組。Fig.4 Effects of luteolin on histopathologic changes and renal fibrosis in mice with HN(A)Representative images of H&E staining of kidney tissue in HN mice treated with luteolin.The black arrows indicate renal tubules dilation and inflammatory infiltration;(B)Representative images of Masson’s trichrome staining;(C)Collagen deposition area analysis;(D)Relative mRNA expression of renal TGF-β;(E)Relative mRNA expression of α-SMA in kidney;(F)Relative mRNA expression of E-cadherin in kidney.#:P＜0.05,##:P＜0.01,###:P＜0.001 vs.the NC group;**:P＜0.01,***:P＜0.001 vs.the HN group.

2.5 木犀草素對(duì)各組小鼠腎臟URAT1 mRNA與蛋白質(zhì)水平的影響

圖5的結(jié)果顯示,通過(guò)氧嗪酸鉀與腺嘌呤誘導(dǎo)尿酸性腎病模型后,HN組小鼠腎臟URAT1 mRNA(圖5A,P＜0.01)與蛋白質(zhì)(圖5B,P＜0.001)表達(dá)水平明顯升高,而高劑量木犀草素(20 mg/kg)能明顯下調(diào)其mRNA(P＜0.05)與蛋白質(zhì)(P＜0.001)表達(dá)水平,使其趨于正常水平。

圖5 木犀草素對(duì)HN小鼠腎臟URAT1 mRNA與蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響(A)各組腎臟URAT1基因表達(dá)水平;(B)各組腎臟URAT1蛋白表達(dá)水平以及蛋白質(zhì)定量結(jié)果。##:P＜0.01,###:P＜0.001 vs.NC組;*:P＜0.05,***:P＜0.001 vs.HN組;ns表示與HN組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Fig.5 Effects of luteolin on the mRNA and protein expression of URAT1 in kidney of mice with HN(A)Relative expression of URAT1 mRNA levels;(B)Relative expression and quantification of URAT1 protein.##:P＜0.01,###:P＜0.001 vs.the NC group;*:P＜0.05,***:P＜0.001 vs.the HN group;ns represents no statistical difference compared with the HN group.

2.6 木犀草素對(duì)HN小鼠腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

結(jié)果如圖6所示,相比于NC組小鼠,HN組小鼠腎臟氧化應(yīng)激水平異常升高,其中MDA含量明顯增加(P＜0.01),SOD活力(P＜0.01)與GSH水平(P＜0.001)均顯著下降,而木犀草素(20 mg/kg)能顯著下調(diào)MDA含量(P＜0.01),增加SOD活性(P＜0.01)與 GSH 水平(P＜0.01)。

圖6 木犀草素對(duì)HN小鼠腎臟MDA、SOD和GSH水平的影響(A)各組腎臟MDA含量;(B)各組腎臟SOD活性;(C)各組腎臟總GSH含量。##:P＜0.01,###:P＜0.001 vs.NC組;*:P＜0.05,**:P＜0.01 vs.HN 組。Fig.6 Effects of luteolin on MDA,SOD and GSH in mice with HN(A)The levels of MDA in kidney;(B)The SOD activities in kidney;(C)The levels of GSH in kidney.##:P＜0.01,###:P＜0.001 vs.the NC group;*:P＜0.05,**:P＜0.01 vs.the HN group.

2.7 木犀草素對(duì)HN小鼠腎臟Nrf2/HO-1通路的影響

進(jìn)一步的機(jī)制研究顯示,與NC組小鼠相比,HN組小鼠腎臟Nrf2的mRNA(P＜0.001)與蛋白質(zhì)(P＜0.001)表達(dá)水平均顯著下調(diào),同時(shí),腎臟HO-1的mRNA(P＜0.05)與蛋白質(zhì)(P＜0.01)表達(dá)水平也均顯著下調(diào);與HN組相比,木犀草素(10 mg/kg)組小鼠腎組織中Nrf2的mRNA(P＜0.05)與蛋白質(zhì)(P＜0.001)表達(dá)水平顯著上調(diào),HO-1的mRNA(P＜0.001)與蛋白質(zhì)(P＜0.001)表達(dá)水平也顯著上調(diào),提示木犀草素可能是通過(guò)激活Nrf2/HO-1通路降低腎臟氧化應(yīng)激水平(圖7)。

圖7 木犀草素對(duì)HN小鼠腎臟Nrf2/HO-1通路的影響(A)各組腎臟Nrf2基因的相對(duì)表達(dá)水平;(B)各組腎臟HO-1基因的相對(duì)表達(dá)水平;(C)各組腎臟Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平以及蛋白質(zhì)定量結(jié)果。#:P＜0.05,##:P＜0.01,###:P＜0.001 vs.NC組;*:P＜0.05,***:P＜0.001 vs.HN組。Fig.7 Effects of luteolin on the Nrf2/HO-1 pathway in mice with HN(A)Relative expression of Nrf2 mRNA in kidney;(B)Relative expression of HO-1 mRNA in kidney;(C)The levels of Nrf2 and HO-1 proteins in kidney.#:P＜0.05,##:P＜0.01,###:P＜0.001 vs.the NC group;*:P＜0.05,***:P＜0.001 vs.the HN group.

3 討論

本文采用氧嗪酸鉀聯(lián)合腺嘌呤的方法建立尿酸性腎病小鼠模型,造模14 d后可觀察到小鼠腎臟出現(xiàn)明顯損傷,伴隨血清尿酸、CR、BUN異常升高。氧嗪酸鉀是一種尿酸酶抑制劑,通過(guò)抑制尿酸酶從而抑制尿酸在體內(nèi)的分解;腺嘌呤可經(jīng)黃嘌呤氧化酶催化最終轉(zhuǎn)化為尿酸。因此,氧嗪酸鉀與腺嘌呤聯(lián)合使用可迅速增加血清尿酸水平,可以用于建立可靠的尿酸性腎病動(dòng)物模型[19～20]。

腎臟是尿酸排泄的主要器官,其排泄尿酸的作用主要依賴于多種表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞的尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體,如負(fù)責(zé)尿酸重吸收的URAT1和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白9(glucose transporter 9,GLUT9)[18,21]。這些尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是腎臟調(diào)節(jié)和保持體內(nèi)尿酸水平穩(wěn)定的關(guān)鍵,也是多種降尿酸藥物的作用靶點(diǎn)[22]。前期研究雖然已報(bào)道了木犀草素的降尿酸作用,但其機(jī)制主要與其抑制黃嘌呤氧化酶活性、上調(diào)ABCG2表達(dá)有關(guān)[5,17]。本文首次發(fā)現(xiàn),木犀草素可體外抑制URAT1轉(zhuǎn)運(yùn)尿酸,降低尿酸水平,并且可下調(diào)尿酸性腎病模型小鼠腎臟URAT1的表達(dá)水平,發(fā)揮降尿酸作用,闡明了木犀草素降尿酸作用的新機(jī)制。

尿酸性腎病進(jìn)展到一定程度后會(huì)出現(xiàn)腎間質(zhì)纖維化[3],TGF-β是纖維化產(chǎn)生的重要介質(zhì),在炎癥和細(xì)胞外基質(zhì)積累中具有至關(guān)重要的作用[23]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Masson染色觀察腎臟中膠原纖維的數(shù)量,發(fā)現(xiàn)模型組小鼠腎間質(zhì)膠原纖維合成明顯增加,木犀草素可明顯抑制上述變化。此外,qRTPCR結(jié)果也表明,木犀草素可抑制纖維化因子TGF-β、α-SMA的mRNA表達(dá),同時(shí)上調(diào)E-cadherin的mRNA表達(dá),減輕腎臟纖維化,發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激是高尿酸誘導(dǎo)的腎臟損傷的主要機(jī)制之一[24]。Nrf2/HO-1通路在機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[12,25]。本研究結(jié)果顯示,木犀草素處理19 d能顯著降低模型小鼠腎臟組織MDA含量,并顯著提高SOD活性與GSH水平,與此同時(shí),Nrf2、HO-1的蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)水平也明顯上調(diào),提示木犀草素具有抑制尿酸性腎病小鼠腎組織氧化應(yīng)激損傷的作用,相關(guān)機(jī)制可能與激活Nrf2/HO-1通路有關(guān)。

綜上所述,木犀草素對(duì)尿酸性腎病小鼠腎臟損傷具有保護(hù)作用,其機(jī)制可能與抑制URAT1從而降低體內(nèi)尿酸水平,抑制腎臟纖維化,激活Nrf2/HO-1通路進(jìn)而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。