穩定表達ABCG2細胞模型的建立及其在篩選ABCG2抑制劑中的應用

鄭鳳欣,趙澤安,林雪曼,吳 婷 ,龐建新

(南方醫科大學藥學院,中國廣東 廣州 510515)

高尿酸血癥(hyperuricemia,HUA)是繼高血壓、高血糖、高血脂之后的人類又一代謝性疾病[1],其發病率呈逐年遞增的趨勢。高尿酸血癥的主要病因是體內尿酸生成過多或排泄不足而導致的體內血液尿酸水平增高,嚴重者會引發痛風。人體血液中的尿酸有大約70%經尿液排泄,30%經糞便排泄。尿酸轉運體在維持人體尿酸平衡中發揮著重要作用,主要包括重吸收轉運體尿酸鹽陰離子轉運體 1(urate anion transporter 1,URAT1)[2]、葡萄糖轉運體 9(glucose transporter 9,GLUT9)[3]、有機陰離子轉運體4(organic anion transporter,OAT4)[4],以及尿酸外排轉運體OAT1/3[5]、ATP結合盒轉運蛋白2(ATP binding cassette subfamily G member 2,ABCG2)[6]等。

ABCG2是ABC轉運蛋白超家族的成員,其最早被稱為乳腺癌耐藥蛋白4(breast cancer resistance protein 4,BCRP4)[7],在乳腺癌細胞[8]中首次被發現。該蛋白質被認為是乳腺癌細胞獲得多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)的原因[9]。研究發現,ABCG2不僅在癌組織中表達,如肝癌、肺癌等[10],在許多正常組織(如小腸和腎)中也高度表達[11]。此外,有研究報道,ABCG2也是維持體內尿酸穩態的重要轉運體[6],負責將尿酸經腎臟與腸道排出體外[12～14]。

目前,降尿酸藥物的開發主要以選擇性抑制URAT1[15]為主,但由于各轉運體之間同源性較高且結構高度相似,URAT1抑制劑難免會對外排轉運體如ABCG2、OAT1/3產生抑制作用。因此,評價化合物對各尿酸轉運體的選擇性至關重要。對于尿酸外排轉運體而言,直接通過細胞進行14C-尿酸攝取實驗是很難的。例如:評價化合物對OAT1/3的抑制活性時,常采用3H-PAH[16]或熒光底物6-CFL[17]進行吸收攝取實驗,但考慮到尿酸與其他底物的結合位點可能不同,評價結果很難真實反映化合物抑制轉運體轉運尿酸的能力。

我們課題組之前已經建立了成熟的URAT1[18]、GLUT9[19]及OAT1[20]抑制劑篩選體系,出于對降尿酸藥物選擇性全面評價的考慮,ABCG2抑制劑的篩選體系的構建也極為重要。本研究采用制備囊泡的方法建立ABCG2抑制劑的體外篩選模型。囊泡轉運實驗是一種成熟的體外方法,用于定量評估ABC轉運蛋白的功能[21]。囊泡作為一個單獨的細胞結構,可在ATP存在的情況下發揮轉運功能。過表達ABCG2的細胞膜囊泡進行14C-尿酸攝取的具體過程為:嵌在膜外的ABCG2接觸ATP后可進行尿酸轉運,而囊泡內側ABCG2由于不接觸ATP無法轉運尿酸,這解決了ABCG2轉運尿酸的方向問題,該方法可直接評價抑制劑對ABCG2轉運尿酸能力的影響。

本文在其他已報道的ABCG2篩選模型[22～23]上加以改進,避免了繁瑣的破碎、分離、提取步驟(圖1)。我們在制備囊泡過程中采用柱式離心法提取膜蛋白及細胞器:細胞高速通過Z字形離心管柱時細胞膜會破裂釋放出核,由此濾去細胞核,得到不含有核膜和核蛋白污染的膜蛋白,再經超高速離心得到膜囊泡。本方法通過固定起始樣品量、離心力和離心時間,就能得到一致性較好的結果,制備過程在2 h內即可完成。此外,在囊泡攝取14C-尿酸實驗中,采用0.45 μm超濾管快速離心回收囊泡,相比于傳統濾紙收集的方式[22],時間短且操作誤差更小。

圖1 ABCG2囊泡制備(A)及抑制劑篩選(B)流程Fig.1 Procedures of ABCG2 membrane vesicle preparation(A)and inhibitor screening(B)

本研究所構建的體外篩選模型,為ABCG2抑制劑的篩選提供了有力工具,對降尿酸藥物選擇性評價具有重要意義。此外,我們利用該模型評價了部分URAT1抑制劑的ABCG2抑制能力,發現RDEA3170具有潛在ABCG2抑制作用,為RDEA3170在臨床上的應用提示了新的機會與風險。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

HEK293細胞(本實驗室保存);表達載體pc-DNA3.1(+)(長沙優澤生物科技有限公司);ABCG2的cDNA序列(NCBI數據庫編號:NM_001257386.2,上海生工生物工程股份有限公司合成);大腸桿菌DH5α(北京全式金生物技術有限公司);質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒(Omega公司,美國);RNA提取試劑盒(成都福際生物科技有限公司);BCA蛋白質定量試劑盒、羊抗兔IgG二抗(杭州弗德生物科技有限公司);ABCG2一抗(杭州華安生物技術有限公司);GAPDH一抗(SAB公司,美國);血清/DM-EM高糖基礎培養基(C11995500BT)、胰蛋白酶(Gibco公司,美國);轉染試劑Lipofectamine 3000(Invitrogen公司,美國);ATP、AMP(北京酷來博科技有限公司);維立諾雷(RDEA3170,純度＞98%,北京華威銳科化工有限公司,結構式如圖2所示);苯溴馬隆、丙磺舒、別嘌醇(純度＞98%,美國Sigma公司,結構式如圖2所示);14C-尿酸(ARC公司,美國)。

圖2 降尿酸藥物苯溴馬隆、丙磺舒、別嘌醇及維立諾雷的結構式Fig.2 Chemical structures of urate lowering drugs benzbromarone,probenecid,allopurinol and verinurad

Z型離心柱(北京英文特生物技術有限公司);0.45 μm超濾管(Millipore公司,美國);小型離心機5415D(Eppendorf公司,德國);超高速離心機(A-vanti JXN-26,美國貝克曼公司);高通量實時熒光定量PCR儀(LC480,美國羅氏公司);液體閃爍計數儀(MicroBeta 2450 Microplate Counter,美國PerkinElmer公司)。

1.2 細胞培養

HEK293細胞在37℃、5% CO2飽和濕度下,使用含DMEM高糖培養基、10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和青霉素-鏈霉素雙抗的培養液進行培養。

1.3 pcDNA3.1(+)-ABCG2載體構建

從NCBI數據庫檢索出ABCG2的cDNA序列,用Primer軟件設計引物序列:正向,5′-GGCCCTCTAGACTCGAGGCCACCATGTCTTCCAGTAATGTCG-3′;反向,5′-TGTTATTTCTTAAAAAATATTCTAAAAGCTTAAG-3′。在ABCG2序列的兩端引入XhoⅠ和HindⅢ兩個限制性酶切位點,以cDNA為模板擴增ABCG2的全長編碼序列(全長1 965 bp)。PCR擴增程序:95℃預變性;94℃變性30 s、58℃退火 30 s、72℃延伸3 min,共進行35次循環;末次循環后在72℃延伸補全10 min,得到擴增產物(現用或-20℃保存)。用Omega膠回收試劑盒回收純化的PCR產物。

將上一步回收的PCR產物與pcDNA3.1(+)空載體用XhoⅠ和HindⅢ在37℃雙酶切12 h,將線性化的載體與ABCG2目的片段用T4連接酶按如下連接體系于4℃連接過夜(12 h)后提取質粒:2 μL T4 DNA ligase buffer、1 μL T4 DNA 連接酶、2 μL純化的PCR擴增產物和8.5 μL的pcD-NA3.1(+)載體,用 6.5 μL 去離子水補齊至 20 μL。

取100 ng上一步的連接產物至冰上溶解的50 μL DH5α感受態中孵育30 min,隨后放在水浴鍋中42℃熱激45 s,立即置于冰上孵育2 min后,加入500 μL無抗LB培養基,在搖床上以200 r/min的速度培養1 h。將菌液涂在含有氨芐青霉素的LB固體培養基上37℃過夜培養,次日挑取單克隆搖菌并提取質粒測序,得到最終質粒pcDNA3.1(+)-ABCG2。取5 μL構建好的pcDNA-3.1(+)-ABCG2質粒,用XhoⅠ和HindⅢ雙酶切后進行電泳鑒定。電泳條件:80 V、50 mA,約40 min后停止電泳,用凝膠成像儀觀察結果。

1.4 HEK293-ABCG2穩轉株構建

將HEK293細胞傳至6孔板,待細胞密度匯合到70%～80%,按照每孔2 500 ng將pcDNA3.1(+)-ABCG2質粒使用脂質體Lipofectamine 3000瞬轉到細胞中,設置1組空白對照組(轉染空載質粒組,HEK293-mock)。轉染24 h后,將細胞消化重懸,按照1∶8傳代至12孔板,待匯合度為50%～70%時,在培養基中加入終質量濃度為600 μg/mL的G418抗生素進行篩選(血清體積濃度為10%),每隔2 d換液。7～10 d后,加大血清體積濃度至20%,繼續篩選14 d。將細胞消化并計數,采用有限稀釋法挑選單克隆細胞進行擴增培養。具體操作:將細胞稀釋為每毫升50～60個,于96孔培養板中每孔加0.1 mL(每孔5～6個細胞);剩余細胞懸液作倍比稀釋,直至每孔含1～2個細胞;待細胞貼壁后,降低G418質量濃度至300 μg/mL(20%FBS),繼續培養擴增;待細胞長滿后消化接種到24孔板,G418增加到600 μg/mL;待細胞數足夠多后,FBS降為10%,繼續擴大培養至細胞密度為90%。采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)及Western-blot方法對穩轉株進行鑒定。

1.5 ABCG2囊泡的制備

將HEK293-ABCG2穩轉株接種到10 cm細胞培養皿中,待其長滿后加入磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)吹懸,3 000g離心1 min,收集細胞沉淀,用TS緩沖液(10 mmol/L Tris-Hepes,250 mmol/L蔗糖,pH=7.4)溶解,將細胞加入到Z型離心管,16 000g離心30 s,棄去離心管柱,振蕩渦旋10 s重懸細胞。用小型離心機以700g離心1 min(沉淀是完整的細胞核)。將上清轉移到新的1.5 mL離心管中,4℃下以16 000g離心30 min,棄去上清(上清為胞漿組份),保存沉淀(沉淀為總膜蛋白組份,包括細胞器和質膜)。TS緩沖液重懸后,用低溫超高速離心機在4℃條件下以100 000g離心60 min,再用25號針管反復吹吸30～50次。制備好的囊泡存放在-80℃備用。

1.6 ABCG2攝取14C-尿酸實驗

為了驗證過表達ABCG2囊泡的14C-尿酸攝取功能,向過表達及未過表達ABCG2的囊泡中分別加入ATP或AMP孵育15 min,隨后加入20 μmol/L的14C-尿酸分別攝取 5 min、10 min、15 min、20 min、30 min,擬合ABCG2攝取14C-尿酸的時效曲線。向囊泡中加入 5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L的14C-尿酸吸收15 min,擬合ABCG2攝取14C-尿酸的量效曲線。

為了評價化合物對ABCG2攝取14C-尿酸的抑制能力,將14C-尿酸加入50 μL膜囊泡混合物中(終濃度為20 μmol/L)。給藥組加入不同濃度抑制劑(空白組與模型組不加抑制劑),在37℃下孵育30 min,使抑制劑與ABCG2完全結合。再加入終濃度為4 mmol/L的ATP(空白組加入AMP作為背景對照,模型組與給藥組加入ATP)開始反應,15 min后立即加入200 μL的冰冷DPBS緩沖液停止反應。將溶液加入0.45 μm超濾管,立即以3 000g快速離心20 s,重復兩次(離心洗掉囊泡外尿酸溶液)。將沉淀取出后放入離心管內,加入200 μL 0.1 mol/L NaOH,使囊泡溶解,釋放囊泡內尿酸,此時的尿酸即為ABCG2攝取的尿酸。加入0.5 mL閃爍劑后渦旋振蕩,使閃爍液與同位素充分混勻,隨后轉移到24孔板內,用液體閃爍計數儀(PerkinElmer,Boston,MA)測定每分鐘的放射值CPM,并計算化合物抑制率。抑制率(%)=[1-(給藥組CPM-空白組CPM)/(模型組CPM-空白組)]×100%。

1.7 qRT-PCR法檢測mRNA表達

將HEK293-ABCG2細胞及HEK293-mock細胞接種到6孔板中,待細胞長滿后采用RNA提取試劑盒按照說明提取細胞總RNA。用SuperScript Ⅲ逆轉錄酶(Invitrogen,美國)反轉錄1 μg RNA,以10 μL的體系合成cDNA模板。以βactin為內參,將cDNA稀釋5倍后用于定量PCR,結果采用2-ΔΔCt法進行計算。本研究使用的qRTPCR引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Primers used for real-time quantitative PCR analysis

1.8 Western-blot檢測ABCG2蛋白表達

將HEK293-ABCG2細胞及HEK293-mock細胞接種到6 cm細胞培養皿中,待細胞長滿后吸棄培養基,加入120 μL RIPA裂解液冰上裂解30 min,期間渦旋振蕩數次,13 000g離心后取上清。取20 μL上清,用BCA蛋白質定量試劑盒定量,加入5×上樣緩沖液,在95℃下金屬浴5 min制得蛋白質樣品。

按每孔20 μg取前述蛋白質樣品進行電泳(濃縮膠濃度為5%,分離膠濃度為10%;電壓條件為濃縮膠:80 V、20 min,分離膠:120 V、80 min)。電泳完畢后將凝膠中的蛋白質采用濕轉法轉移至0.45 μm的PVDF膜上,轉膜條件為100 V、80 min。用5%脫脂牛奶封閉1 h,加入相應的一抗(ABCG2一抗稀釋比例1∶1 000,GAPDH一抗稀釋比例1∶1 000),在4℃孵育過夜;次日用含有0.1%吐溫20的TBST緩沖液洗膜3次(每次10 min),隨后室溫孵育羊抗兔酶標二抗(稀釋比例1∶5 000)1 h;用TBST洗膜6次(每次5 min)后,加入化學發光液在曝光機下曝光,采用Image J軟件進行定量分析。

1.9 統計分析

2 結果

2.1 重組質粒的鑒定

pcDNA3.1(+)與ABCG2連接后的重組質粒圖譜見圖3A,在酶切位點XhoⅠ和HindⅢ中間插入了目的基因ABCG2的序列。重組質粒經XhoⅠ和HindⅢ雙酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳,電泳結果如圖3B所示,目的基因ABCG2與載體pcDNA3.1(+)的大小分別為1 965 bp和5 428 bp左右。測序所得的序列與預期一致,說明重組質粒構建成功。

圖3 質粒pcDNA3.1(+)-ABCG2圖譜(A)及其酶切后的電泳圖(B)Fig.3 The pcDNA3.1(+)-ABCG2 map(A)and its electrophoretogram after enzyme digestion(B)

2.2 穩轉株的表達鑒定

qRT-PCR結果表明,熔解曲線為單峰曲線,說明引物特異性好。圖4A顯示,ABCG2穩轉株mRNA的含量與HEK293-mock細胞相比,提高了1 717.5倍,這從mRNA水平證明ABCG2穩轉株過表達。Western-blot結果表明,ABCG2穩轉株的蛋白質表達水平為HEK293-mock細胞的2.64倍(圖4B)。

圖4 HEK293-ABCG2細胞和HEK293-mock細胞中ABCG2的mRNA(A)及蛋白質(B)表達水平(***:P＜0.001,n=3)Fig.4 Relative mRNA(A)and protein(B)expression levels of HEK293-ABCG2 and HEK293-mock cells(***:P＜0.001,n=3)

2.3 ABCG2囊泡對14C-尿酸的攝取能力

由于ABCG2為尿酸外排轉運體,普通細胞無法進行攝取實驗,為了驗證穩轉株中ABCG2的功能,我們將細胞制備成膜囊泡進行14C-尿酸攝取實驗。結果顯示,加入AMP時,HEK293-ABCG2制備的囊泡的尿酸吸收能力較弱,與HEK293-mock細胞組相當;而在ATP存在的情況下,含有ABCG2的囊泡轉運尿酸的能力顯著強于未過表達ABCG2的囊泡,且呈時間依賴性和濃度依賴性(圖5)。值得注意的是,未過表達ABCG2的囊泡對尿酸的轉運也呈一定的劑量依賴性,這是因為HEK293-mock細胞中也含有少量ABCG2以及其他尿酸轉運體。

圖5 ABCG2囊泡轉運14C-尿酸的時效(A)與量效(B)曲線(n=3)Fig.5 The time-effect curve(A)and dose-response curve(B)of14C-uric acid transport by ABCG2 vesicles(n=3)

2.4 降尿酸藥物對ABCG2轉運體的抑制作用

根據時效量效曲線結果,我們選擇20 μmol/L的14C-尿酸吸收15 min,考察降尿酸藥物苯溴馬隆、丙磺舒、別嘌醇及處于臨床研究中的RDEA-3170對ABCG2轉運體的抑制作用。結果顯示,丙磺舒、別嘌醇在50 μmol/L的濃度下幾乎不抑制ABCG2,而苯溴馬隆在5 μmol/L濃度下對ABCG2的抑制率為77.85%,RDEA3170在5 μmol/L時的抑制率為58.12%(圖6)。梯度濃度實驗顯示,苯溴馬隆抑制ABCG2的IC50值為(3.45±1.09)μmol/L,與文獻報道[22]相當;RDEA3170抑制ABCG2的IC50值為(9.90±2.11)μmol/L(圖7)。上述結果表明,苯溴馬隆、RDEA3170具有較強的ABCG2抑制能力。

圖6 苯溴馬隆、RDEA3170、別嘌醇、丙磺舒對ABCG2的體外抑制活性(n=3)**:P＜0.01 vs.空白組;#:P＜0.05,###:P＜0.001 vs.模型組(只加尿酸組)。Fig.6 Inhibitory effects of benzbromarone,RDEA3170,allopurinol and probenecid on ABCG2 in vitro(n=3)**:P＜0.01,compared with the control group;#:P＜0.05,###:P＜0.001,compared with the model group treated with uric acid alone.

圖7 苯溴馬隆(A)與RDEA3170(B)體外抑制ABCG2的IC50值Fig.7 IC50values of benzbromarone(A)and RDEA3170(B)against ABCG2-mediated urate transport in vitro

3 討論

隨著人們生活水平的不斷進步,高尿酸血癥的發病率也在不斷增加。然而,已有的治療高尿酸血癥的藥物卻少之又少。而且,目前上市的降尿酸藥物如苯溴馬隆、丙磺舒、別嘌醇等均有不同程度的副作用及毒性,如:苯溴馬隆具有肝毒性[24],別嘌醇具有胃腸道反應[25]等,這些藥物處于被淘汰的邊緣[26]?，F階段,選擇性針對URAT1設計的抑制劑有望成為下一代降尿酸藥物,但是藥物對尿酸外排轉運體如ABCG2、OAT1/3的作用會抵消URAT1的降尿酸作用,此外也會帶來嚴重的毒性及不良反應。研究報道,高尿酸血癥合并慢性腎病的患者使用苯溴馬隆會增加其患尿毒癥的風險,原因是苯溴馬隆抑制ABCG2,影響有毒物質的排泄[27],如硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate,IS)。同時,苯溴馬隆的ABCG2抑制作用也可能導致聯合用藥時不良藥物相互作用的發生[28]。這提示,開發選擇性URAT1抑制劑,必須要評價其對ABCG2的抑制能力。

目前,ABCG2抑制劑的體外篩選系統主要分為基于膜及基于細胞的篩選系統?；谀さ南到y主要包括囊泡法,該方法利用囊泡可以進行同位素標記的底物如尿酸、雌激素酮(estrone sulfate,ES)及ATP的檢測[29]。此外,也有報道將ABCG2重組在人工制備的脂質體上,但該方法成本較高,不易制備[29]?；诩毎暮Y選系統是以ABCG2為藥物轉運體,通過檢測化療藥物的耐藥性[30]及遷移能力[31],間接評價ABCG2的轉運能力,但是該類方法不夠直觀,只能間接評價化合物對ABCG2的抑制能力。研究降尿酸化合物的ABCG2抑制能力,制備膜囊泡攝取同位素標記的尿酸是最直接最有效的方法。本文中,我們對報道過的囊泡制備方法[32～33]加以改進,分離出過表達ABCG2的膜囊泡,成功構建了體外篩選模型。該模型能用于評價化合物抑制ABCG2的能力,相比于其他方法,簡化了囊泡制備及最后的收集步驟,具有時間短、重現性好的優點。

研究發現,臨床常用降尿酸藥物苯溴馬隆、丙磺舒選擇性低,對多種尿酸轉運體均有抑制作用,包括ABCG2[26]。別嘌醇為黃嘌呤氧化酶抑制劑,主要通過抑制尿酸生成發揮降尿酸作用,其對尿酸轉運體的功能沒有影響[34]。因此,本文選擇苯溴馬隆、丙磺舒為陽性對照藥物,別嘌醇為陰性對照藥物。RDEA3170是阿斯利康公司目前正在推進的重磅降尿酸治療藥物,現已進入Ⅱ期臨床試驗[35],其體外選擇性抑制URAT1的IC50低至0.025 μmol/L[36],在臨床上展現出了較好的安全性與藥效[37],但是其對ABCG2是否有抑制作用仍無報道。本文結果顯示,RDEA3170也有較強的ABCG2抑制作用。雖然本文發現,RDEA3170對ABCG2的抑制能力弱于其對URAT1的抑制活性,但是也提示了RDEA3170的降尿酸效果可能會由于ABCG2的抑制作用被部分抵消,或者可能由于抑制ABCG2而在藥物-藥物相互作用中發揮作用。

已有研究報道,高尿酸血癥與癌癥的發生、發展、復發、轉移及預后有關[38],血清尿酸水平升高可以增加惡性腫瘤發病率和死亡率[39]?？梢?控制高尿酸血癥對于腫瘤患者十分重要。ABCG2是多種抗腫瘤藥物耐藥性產生的主要原因。因此,抑制ABCG2可減少抗腫瘤藥物的排出,達到藥效增強的效果。ABCG2也參與調控多種藥物的藥代動力學過程,如舒尼替尼[40]、伊立替康[41]、吉非替尼[42]等,影響它們的療效。因此,尋找ABCG2抑制劑能更好地增強類似抗腫瘤藥物的效果[43]。有趣的是,本文檢測的多個降尿酸藥物,包括苯溴馬隆、丙磺舒與RDEA3170,都具有一定的ABCG2抑制作用,提示高尿酸血癥合并癌癥的患者可以服用上述降尿酸藥物,但同時也警示我們,上述藥物與其他藥物合用時會引起藥物-藥物相互作用,增加其他藥物的血藥濃度,因此要隨時監測患者血藥濃度,防止藥物濃度過高而引起不良反應。

綜上所述,本研究對發現ABCG2抑制劑提供了有力的工具,為高尿酸血癥合并腫瘤的患者提供了用藥參考。