不同方法建立長期慢性高尿酸血癥模型及對相關并發癥影響的研究進展

張樂琦,林翠婷,黃清華,吳 婷,楊 陽*

(1.南方醫科大學附屬佛山市婦幼保健院,中國廣東 佛山 528000;2.南方醫科大學藥學院,中國廣東 廣州 510515)

高尿酸血癥(hyperuricemia,HUA)是機體內尿酸生成過多或/和排泄障礙造成的尿酸體內積聚的現象。2019年中華醫學會內分泌學分會發布的《中國高尿酸血癥與痛風診療指南》指出,非同日、2次空腹血尿酸大于420 μmol/L(成年人,不分男性、女性)即可診斷為HUA[1]。國內外流行病學數據顯示,HUA發病率呈逐年升高且年輕化趨勢[2～3]。長期HUA可誘發多種并發癥,如痛風[4]、Ⅱ型糖尿病[5]、心血管疾病[6～7]、肝腎功能損傷[8～9]等。當前應用的HUA動物模型大多數為考察尿酸體內生成和排泄,這僅需要動物短期維持高水平尿酸即可達到研究目的。然而,HUA相關并發癥是長期高尿酸慢性誘導作用下的結果。為更真實模擬和研究人體HUA并發癥的病理誘導過程,構建長期、穩定的HUA動物模型顯得尤為重要。本綜述從主流藥物造模方法、模式動物選擇和基因干預造模3個方面,對當前HUA模型構建方法的長期應用進行優劣評價,并展望新型模型和技術的未來發展方向,為今后HUA長期并發癥體內研究的模型選擇提供參考。

1 主流藥物造模方法的優劣分析

1.1 用于HUA造模的藥物及其作用機制

當前,大部分實驗使用較多的造模方法仍是以通過藥物干預為主的方式增加尿酸來源、抑制尿酸代謝及排泄,主要造模藥物包括氧嗪酸鉀(potassium oxonate,PO)、次黃嘌呤(hypoxanthine,HX)、腺嘌呤(adenine,AD)、乙胺丁醇(ethambutol,EMB)、煙酸(nicotinic acid,NA)、果糖(fructose,FRU)、酵母(yeast,YE)等。文中匯總了這些造模誘導劑[10～24]的機制、給藥方式,并對成模性進行評價(表1)。根據造模藥物的作用機制,現有的研究提示,基于氧嗪酸鉀和次黃嘌呤的模型更有利于評價尿酸的生成以及重吸收[25～27],而基于腺嘌呤的模型更有利于評價HUA下的腎臟損傷及干預保護[18,28],基于果糖的模型更有利于評價HUA合并糖尿病等代謝性紊亂的機制及改善效應[29～30]。單獨應用乙胺丁醇及煙酸誘導HUA鮮有報道,其常與外源性尿酸前體物質聯合誘導[19～20]。

表1 HUA造模常用藥物及成模性評價Table 1 Commonly used chemical inducers for HUA and the modeling ability

1.2 聯合造模在慢性HUA并發癥中的應用

HUA并發癥的自發性誘導需要維持組織器官每日的高尿酸暴露時間以及誘導周期。由于非靈長類哺乳動物大都表達尿酸酶,當誘導劑代謝或排泄后,實驗動物體內的尿酸水平迅速回落[31]。單一誘導劑往往難以觀察到并發癥現象,在當前研究中,人們常常需使用兩種以上的聯合造模劑誘導組織器官的慢性病變。聯合藥物誘導HUA并研究其并發癥的模型較多,并無均一標準,鮮有文獻系統性評價方法的適用性。我們整理了現有聯合造模誘導方法[32～38]對尿酸水平以及并發癥的誘導效果(表2),發現在聯合造模模型藥物選擇中,氧嗪酸鉀是絕大多數實驗的選擇,其聯合腺嘌呤、次黃嘌呤、酵母膏在尿酸升高倍數上均有較好的表現。但是,當前關于HUA并發癥的研究多集中于腎臟損傷,對其他組織器官損傷的模型探索較少。

表2 聯合造模對HUA并發癥的誘導效果Table 2 Induction effects of combined chemical inducers on HUA-associated complications

2 模式動物選擇

由于生理病理過程與人類相似且飼養方便,大多數研究選擇嚙齒類動物作為HUA的模式動物,包括SD大鼠、昆明小鼠和C57小鼠等。然而,不同于人類的是,這些動物均能合成尿酸酶,在體內將尿酸代謝為可排泄的尿囊素[31]。這一特征正是當前藥物誘導劑造模難以保證組織器官長期持續性高濃度尿酸暴露的原因,這亦使得相關并發癥難以被觀察到。

相比而言,禽類的嘌呤代謝途徑與人類更為相似,其僅需在基礎飼料中添加次黃嘌呤、酵母等尿酸前體物質或腺嘌呤影響尿酸排泄即可誘導穩定的HUA模型。當前,常用的以禽類為主的HUA模型主要選擇雞或鵪鶉作為模式動物。在雄性迪法克鵪鶉飼料中添加15 g/kg的酵母粉,飼喂140天后血清尿酸水平顯著性升高,在第60天時研究人員可檢測到血清甘油三酯水平的顯著性上升,第90天時血清葡萄糖水平呈現顯著性上升。同時,該模型中血清黃嘌呤氧化酶以及胰島素水平均顯著性升高,這是機體氧化應激以及胰島素耐受的表現,也是多器官損傷的病理基礎。然而,在該研究總計140天的實驗周期中,肝腎功能的顯著性變化并未被觀察到[39]。該模型的規律與人類飲食結構規律改變類似,可用于模擬自然慢性損傷,但其存在實驗周期過長的缺點。近年來有研究表明,在高脂高嘌呤飲食的基礎上皮下注射氧嗪酸鉀200 mg/kg可進一步提升鵪鶉血清尿酸水平約1.5倍,且在14周后可觀察到主動脈壁的脂質沉積、斑塊形成,以及腎小球的脂質沉積和腎小管的空泡變性[40]。這說明通過進一步提高尿酸水平可加速HUA并發癥進程。然而,當前大多數實驗室缺乏進行禽類飼養的條件,在模型推廣上或許有一定難度。

近年來,基于斑馬魚的疾病模型受到廣泛關注,斑馬魚與人類基因高度同源,生物結構與生理功能和人類亦高度相似,且其有易于繁殖、實驗周期短、實驗藥量小、給藥方式簡單的優點。當前,基于斑馬魚的HUA模型尚處于摸索的起步階段。研究顯示,使用200 μmol/L氧嗪酸鉀聯合10 μmol/L黃嘌呤可提升斑馬魚體內尿酸水平約2倍,該方法可作為急性HUA模型[41],該模型可應用于化合物的降尿酸效果的快速評估[42]。然而,作為新興模式動物,當前斑馬魚的HUA造模方法缺乏長期慢性狀態下的有效性評估。

靈長類動物的尿酸合成代謝途徑與人類最為相似,但由于其飼養難度大以及實驗成本高昂,鮮少用于HUA相關研究。近期研究顯示,給予雄性恒河猴200 mg/kg肌苷腹腔注射1 h后,血清尿酸濃度提高約4倍;然而,4 h后血清尿酸即回落至基線[43]。該方法并不適用于長期慢性HUA及相關并發癥影響的評估。

3 基因干預造模

3.1 當前針對HUA的基因干預靶點

尿酸在動物體內可在尿酸酶作用下降解為可溶性尿囊素排出體外,或通過腎臟和腸道排泄。因此,當前基因干預靶點主要分布于編碼尿酸酶的UOX(urate oxidase)、負責腎臟重吸收的URAT1(urate transporter 1)和GLUT9(glucose transporter 9),以及負責腸道排泄的ABCG2(ATP-binding cassette transporter,subfamily G,member 2)[44]。近年,基于全基因組關聯的研究顯示,GLUT12(glucose transporter 12)是一種生理性尿酸鹽轉運蛋白,其功能障礙會導致血尿酸濃度的升高,提示其或許可以作為新的干預靶點[45]。此外,在腸道排泄中,PDZK1(PDZ domain-containing 1)和 ABCG2 的表達高度相關,敲除PDZK1可間接性導致ABCG2的表達同步下調,進而減少尿酸腸道排泄[46]。

3.2 基因干預對尿酸水平的影響

如表3所示,當前研究中針對HUA的基因干預造模所選用的小鼠以C57BL系列為主,不同基因的敲除對于模型動物的獲得數以及尿酸水平的提高具有較大差異[45,47～54]。UOX敲除可以使得血尿酸水平大幅升高,然而其死亡率也較高,因此其操作性并不強。URAT1的敲除并不能使得尿酸水平顯著性升高,因此不適用于建立HUA模型。GLUT9的敲除,在系統性敲除和特定組織器官敲除中具有不同的效果,系統性敲除GLUT9具有胚胎致死性,而肝特異性敲除則沒有,且可大幅升高血尿酸濃度。

表3 基因干預對血尿酸水平的影響Table 3 Effect of genetic intervention on blood uric acid level

3.3 基因干預誘發的急慢性并發癥

早在1994年就有研究者利用胚胎干細胞同源重組的方法構建UOX基因敲除小鼠,在5周齡UOX敲除小鼠的腎臟中可見大量尿酸結晶以及腎小管急性萎縮,這也是誘發小鼠大量死亡的原因[47]。近年,有研究者通過TALEN技術進行雜合子敲除,然后將敲除后的小鼠交配獲得UOX純合小鼠,這種方法提升了小鼠存活率,這些小鼠均表現出顯著的腎功能障礙,其中雄性小鼠伴有顯著性的胰腺損傷以及胰島素分泌受損,而雌性小鼠伴有高血壓以及脂代謝障礙[48]。在UOX敲除的雄性小鼠中,輔以鏈脲霉素飼養可加速胰島β細胞損傷及誘導糖尿病[49]。

在雜交獲得的系統性GLUT9基因敲除小鼠中,研究者觀察到腎臟梗阻性結石、腎小管間質炎癥和皮質的進行性炎癥纖維化,以及輕度腎功能不全[51]。與此不同的是,在肝臟特異性敲除GLUT9后,雖然尿酸水平出現大幅升高,但并無顯著性的腎臟以及心血管損傷[51,55];在腸上皮細胞特異性敲除GLUT9后,機體出現脂代謝紊亂、血壓升高以及心臟重構的現象[52]。另有研究顯示,條件性誘導腎GLUT9敲除1周后,收縮壓和舒張壓雙重下降,同時心率升高[53]。

4 展望

隨著發病率的逐年升高,HUA長期慢性所伴隨的并發癥問題亦浮出水面。當前,大多數動物模型僅用于短期降尿酸篩選,關于其長期并發癥甚少。雖然藥物聯合模型在長期慢性HUA中具有良好的表現,但器官損傷也多集中于腎臟,對其他如心血管系統、代謝系統并發癥鮮有提及。建立合適的長期藥物造模方法并系統性評估其對多種慢性并發癥的影響,對今后HUA相關研究的發展具有良好助力。

當前,大多數實驗室主要選擇小鼠或大鼠進行HUA模型構建,而嚙齒類動物由于表達尿酸酶并不是最佳的HUA模式動物,因此,今后研究人員可進一步推動其他模式動物如禽類在HUA相關領域的應用。由于飼養便捷且廉價,斑馬魚被廣泛用于藥物篩選實驗,但其在HUA上的方法建立尚不成熟,在未來條件優化后或許會有良好的表現。

通過基因干預誘導HUA模型是今后重要的發展方向。在當前研究中,UOX敲除可引起尿酸水平的顯著性升高,然而其死亡率高且子代獲得困難。其次為GLUT9,尤其是肝特異性敲除GLUT9后,實驗動物在存活率以及尿酸升高倍數上均有良好表現。其實,無論是何種敲除,均需考慮該基因及尿酸水平對胚胎發育的影響,在未來條件性誘導敲除或許是解決胚胎致畸致死或成年前死亡率過高的發展方向。