平歐榛子分離蛋白提取條件優化

魏雅靜，楊 宇，祝開陽

（阜新市產業技術創新推廣中心（阜新市產業技術研究院），遼寧阜新 123000）

榛子是世界四大干果之一，營養豐富，果仁中含有B族維生素、人體必需氨基酸、多種礦物質元素、高含量蛋白質和豐富的脂肪等成分[1]。平歐榛子是由平榛與歐洲榛種間雜交產生的新品種，具有果大、豐產、抗寒性強和果仁質量好等特點[2]。

常用的蛋白質提取方法有水溶液提取、堿溶酸沉[3]、有機溶劑提取及酶法提取等。其中堿溶酸沉法由于操作簡單、容易控制、成本低廉應用最廣泛，且所得產品蛋白質含量較高，經濟實用性強，因此試驗采用堿溶酸沉法提取平歐榛子蛋白質，以蛋白提取率為指標，得到榛子分離蛋白最佳提取條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

平歐榛子，購于本溪縣三陽大果榛子專業生產合作社。考馬斯亮藍G-250，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；牛血清白蛋白，北京奧博星生物技術有限責任公司；鹽酸、氫氧化鈉、硫酸、甲基紅、溴甲酚綠、乙醇、石油醚（30～60 ℃）和正己烷均為分析純，購于國藥集團。

1.2 儀器與設備

pHS-25數顯pH計，上海精密科學儀器有限公司；TDL-40B臺式離心機，上海安亭科學儀器廠制造；DHG-9070A電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏飾演設備有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；FD-IC-80高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有公司；SHA-C恒溫振蕩器，國華電器有限公司；DSA30-TM1超聲波清洗器，福州德森精工有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預處理

去殼后的榛仁室溫靜水浸泡15 h，去皮，50 ℃烘箱烘干，粉碎機破碎后過40目篩。料液比1∶5（g∶mL）加入正己烷，50 ℃超聲波提取30 min，4 000 r/min離心20 min，倒去正己烷（回收利用），殘留的正己烷在通風櫥中揮發，按照上述步驟重復提取一次得到榛子脫脂粉，放入-20 ℃冰箱中備用。

1.3.2 可溶性蛋白質含量的測定

采用考馬斯亮藍測定可溶性蛋白質含量[4]。配制不同濃度梯度的標準蛋白質（Bovine Serum Albumin，BSA）溶液，加入考馬斯亮藍G-250充分混合，在595 nm處測吸光值，繪制蛋白質標準曲線，計算回歸方程，利用回歸方程求出樣品蛋白質含量。

1.3.3 榛子分離蛋白的制備

榛子分離蛋白的制備采用堿溶酸沉法。脫脂榛子粉與去離子水以一定比例混合均勻，用1 mol/L的NaOH調節pH，在恒溫振蕩水浴中浸提一段時間，5 000 r/min離心20 min，收集上清液，用1 mol/L HCl調至等電點5 000 r/min離心20 min，棄上清液，冷凍干燥得榛子分離蛋白[5]。榛子蛋白質提取率計算：

式中：M為脫脂榛子粉質量，g；Mt為上清液中蛋白質含量，g；C為脫脂榛子粉中蛋白質含量，%。

1.3.4 單因素試驗

以蛋白質提取率為指標，對影響蛋白質提取率的主要因素pH（7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0），溫度（35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃和60 ℃），時間（30 min、40 min、50 min、60 min、70 min和80 min），料液比（1∶8、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30）（g∶mL）進行單因素試驗。基礎水平設置為pH為9.0、溫度50 ℃、提取時間60 min、料液比1∶15（g∶mL）。

2 結果與分析

2.1 蛋白質回歸方程

如圖1所示，利用蛋白質標準曲線計算回歸方程為y=6.72x+0.149，R2=0.996 9，表明方程線性擬合度良好，可以運用此方程作為測定蛋白質含量的依據。

圖1 蛋白質含量標準曲線

2.2 榛子分離蛋白提取工藝單因素分析

2.2.1 pH值對榛子分離蛋白提取率的影響

如圖2所示，在pH在7.5～9.0，隨著pH的升高，蛋白提取率逐漸升高，這可能是因為堿液使蛋白質中的部分化學鍵尤其是氫鍵遭到破壞，基團解離，導致蛋白質中緊密結構變得松散，促進蛋白質分子的溶出[6]。當pH為9.0時，提取率達到最高值為72.77%。之后蛋白質提取率明顯下降，這可能是因為高pH環境會使氨基酸殘基發生異構化，形成外旋混合物，同時堿性過高會導致蛋白質發生變性，水溶性降低。因此提取榛子分離蛋白最佳pH為9.0。

圖2 pH值對榛子分離蛋白提取率的影響

2.2.2 溫度對榛子分離蛋白提取率的影響

如圖3所示，35～50 ℃條件下，隨著溫度的升高，蛋白提取率呈上升趨勢，當溫度為50 ℃時，達到最高值為73.15%。這可能是因為溫度較低時蛋白質分子和水分子不能充分進行相互作用，溫度逐漸上升，二者之間相互作用加強，蛋白質的溶解度隨之提高，提取率也相應提高。50 ℃以后蛋白提取率與溫度呈負相關，這可能是因為過高的溫度使部分蛋白質發生變性而聚集沉淀，影響蛋白質溶出率，且高溫可能會增強榛子脫脂粉中碳水化合物等成分的黏性，促使其與蛋白質發生黏合，從而使榛子分離蛋白的提取率下降[7]。因此提取榛子分離蛋白最佳溫度為50 ℃。

圖3 溫度對榛子分離蛋白提取率的影響

2.2.3 提取時間對榛子分離蛋白提取率的影響

如圖4所示，當提取時間從30 min增加到60 min，蛋白提取率明顯提高，從54.42%提高到72.14%，這是因為在初提階段，榛子分離蛋白沒有完全溶解，隨著提取時間的延長，蛋白的溶出量逐漸增加，提取時間為60 min時蛋白溶出接近飽和狀態，增加提取時間，也只能溶出很少的蛋白質。因此，后來隨著提取時間的延長，榛子分離蛋白的提取率增加緩慢，并且提取時間過長，產品衛生質量受到影響，為了保證產品質量、節約能源、降低成本，確定最佳提取時間為60 min。

圖4 提取時間對榛子分離蛋白提取率的影響

2.2.4 料液比對榛子分離蛋白提取率的影響

如圖5所示，當料液比（g∶mL）在1∶8～1∶15，提取率增長速度較快，當料液比為1∶15（g∶mL）時達到73.89%。這可能是因為當料液比較小時，溶液的黏度大，分子間的阻力比較大，影響蛋白質的溶出速率，隨著料液比的增加，水分子與蛋白質分子接觸面積增大，從而促進了蛋白質的溶解。之后，隨著料液比的繼續增加，蛋白質的提取率增加緩慢。這可能是因為大部分蛋白質已經基本溶出，在現有的條件下，即使料液比繼續提高，對蛋白質的溶解也無明顯提高的作用。陶健[8]在蕎麥蛋白的制備中發現，料液比較大時，在酸沉過程中有大量蛋白質從粗蛋白母液流失到乳清中，若母液中蛋白質濃度過低，會使酸沉現象不發生，并且料液比過大會增加生產成本，考慮到節省資源、降低成本和保證酸沉工序正常進行，以料液比1∶15（g∶mL）作為最佳提取蛋白的比例。

圖5 料液比對榛子分離蛋白提取率的影響

3 結論

試驗以平歐榛子為原料，通過堿溶酸沉法提取平歐榛子分離蛋白，最終優化條件為pH值9.0，溫度50 ℃，提取時間60 min，料液比1∶15（g∶mL），平行測定3次，取平均值。在此條件下蛋白質提取率最高為73.64%。