明膠對鮰魚卵肽 - 鈣納米粒的形成及熱穩定性的影響

劉燕玲，李宛怡*，黃 昊，梁東明，麥旖旎

（1.南寧師范大學北部灣環境演變與資源利用教育部重點實驗室，廣西南寧530001；2.南寧市食品藥品檢驗所，廣西南寧 530001；3.南寧威耀供應鏈管理有限公司，廣西南寧 530001；4.南寧海關技術中心，廣西南寧 530001）

鈣是人體生命活動中最重要的礦物元素之一，它參與人體新陳代謝、細胞的生長繁殖及生物大分子水平活動，因此鈣是人體的生命之本[1]。隨著技術的發展，市面上的補鈣劑越來越多，國家市場監督管理總局公布的數據顯示，補鈣劑高達1 740種，批準使用的補鈣劑保健品為896個，但無機鈣與有機鈣占市場比例較大。這些補鈣劑生物利用低，對胃腸道的破壞性大。有研究表明第四代補鈣劑納米鈣與前幾代補鈣劑相比具有較多優勢[2-5]，如生物利用率高、鈣量大、對胃腸的應激作用小，熱穩定性好，特別適合一些老人、兒童及孕婦服用[6]。傳統的納米粒制備技術有分解與聚集兩種方法，但這些方法需要精密、復雜的設備，并且損耗大量的能量，在應用上不方便、不經濟，成本較高。近年來，受到生物礦化的啟發，肽被用來作為生物模板在溫和條件下合成鐵、鈣等礦物質納米粒[7-9]。因此生物分子納米鈣有望成為新一代的補鈣劑。在前期研究中，項目組已經探究了肽-鈣納米粒的形成條件[10]，熱穩定性尚未有深入的研究。鯉魚卵肽-鈣納米粒在121.1 ℃的高溫下處理15 min后鈣的保留率顯著下降[7]。牡蠣肽-鋅納米粒在50 ℃的水浴中加熱15 min后，發現其聚集沉淀，熱穩定較差[11]。因此探究鮰魚卵肽-鈣納米粒的穩定性是十分必要的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚卵肽，自制；食用明膠，河南佰榮生物科技有限公司；實驗所用其他試劑均為分析純以上。

1.2 儀器與設備

UV-201型紫外分光光度計，日本島津公司；ME303E/02型電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；ST3100型實驗室pH計，奧豪斯儀器常州有限公司；HH-4型數顯恒溫水浴鍋，常州普天儀器制造有限公司；電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；DJ1G型精密增力電動攪拌器，常州市金壇大地自動化儀器廠；ZHSY-50WS型水浴往復恒溫振蕩培養箱，廈門地坤科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 明膠對鮰魚卵肽-鈣納米粒熱穩定性的影響

稱取一定量的明膠，在60 ℃的水浴鍋加熱溶解，使其初始濃度為1.5%、3.0%、4.5%。預先制備納米粒分散液，準備3份等量的1%魚卵肽溶液以1∶1的體積與15 mmol/L CaCl2混合搖勻，調節pH值為8.0，靜止2 h，在600 nm測定其濁度為初始濁度。然后加入濃度為0%、1.5%、3.0%和4.5%的明膠（其終濃度為0%、0.5%、1.0%和1.5%）溶液混勻靜置10 min測其濁度。將上述的鮰魚卵肽-鈣納米顆粒-明膠體系在40～100 ℃加熱15 min后冷卻測其濁度，以室溫濁度為標準，研究濁度隨溫度變化的情況。

1.3.2 明膠對鮰魚卵肽-鈣納米粒形成的影響

參照黃海等[11]的方法略有修改，預先配制2.0%、4.0%、6.0%系列濃度明膠溶液，分別與10 mmol/L、20 mmol/L、30 mmol/L、40 mmol/L和50 mmol/L系列濃度氯化鈣溶液以1∶1的體積混合均勻，再與1%的鮰魚卵肽溶液以1∶1體積比混合（混合后體系中肽濃度為0.5%，明膠濃度分別為0%、0.5%、1.0%和1.5%，氯化鈣濃度分別為2.5 mmol/L、5.0 mmol/L、7.5 mmol/L、10.0 mmol/L和12.5 mmol/L），每種混合溶液均調節pH至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，靜置2 h后，在600 nm處測定濁度。

1.3.3 加熱對明膠-鮰魚卵肽-鈣納米粒的影響

選擇上述幾種能形成納米粒的條件（固定鮰魚卵肽濃度為5 g/L，氯化鈣為7.5 mmol/L，pH 為8，分別在不加明膠、加0.5%明膠、1.0%明膠、1.5%明膠；當pH為7，不加明膠、加0.5%明膠、1.0%明膠、1.5%明膠）制備納米粒分散液，并置于40～100 ℃水浴加熱15 min，以未加熱的初始濁度為標準，研究濁度隨溫度變化的情況。

1.3.4 數據處理

所有實驗均做3個平行，運用SPSS統計軟件進行方差分析和LSD檢驗。數據以均數±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 明膠對鮰魚卵肽-鈣納米粒熱穩定性影響

明膠可以作為一種食品添加劑添加到食品中，具有良好的增稠、增穩效果。其增稠的機理主要有兩個方面，即膠束被改變與形成新的三維網絡結構[12]。因此明膠也可作為食品添加劑加到鮰魚卵肽-鈣納米粒中。當鮰魚卵肽濃度為5 g/L、氯化鈣為7.5 mmol/L、pH為8，形成鮰魚卵肽-鈣納米粒后，在加熱條件下觀察0%明膠、0.5%明膠、1.0%明膠和1.5%明膠4種樣液的濁度變化。如表1所示，鮰魚卵肽-鈣納米粒在加熱的作用下會失穩集聚甚至出現沉淀。出現聚集沉淀的原因可能是鮰魚卵肽在加熱的條件下發生了變性，導致其空間結構改變，鈣離子結合能力下降，納米粒失穩。大豆肽-鈣復合物的受熱性能卻能達到80 ℃，一級結構穩定性強，蛋白發生變性的概率小。不加明膠加熱的納米粒在50℃以上開始發生沉淀，當加入0.5%、1.0%、1.5%明膠后，納米粒的耐熱性提高至60 ℃、70 ℃、80℃。因此明膠可以提高鮰魚卵肽-鈣納米粒的熱穩定性，濃度越高，耐熱性越好，其原因可能是明膠具有增稠增黏的作用，可形成良好的保護膜。

表1 明膠對納米粒熱穩定性的影響

2.2 明膠對鮰魚卵肽-鈣納米粒形成的影響

明膠可以顯著提高鮰魚卵肽-鈣納米粒熱穩定性的前提是預先制備納米粒，通過實驗驗證明膠對鮰魚卵肽-鈣納米粒形成及熱穩定性的影響。明膠參與鮰魚卵肽鈣-納米粒的形成，如圖1所示。明膠加入體系中，鮰魚卵肽-鈣納米粒形成條件發生了改變。①從pH變化來講，加入0.5%的明膠，鮰魚卵肽-鈣納米粒的形成條件為10～12.5 mmol/L氯化鈣濃度，pH 6～7。納米粒的形成條件向著高pH的方向進行。隨著明膠的加入，鮰魚卵肽的等電點及帶電量發生了改變，且體系的黏稠度增加使分子內摩擦阻力增加，分子流動性下降，需要pH調節反應體系的電荷平衡從而參與納米顆粒的形成與穩定。②從氯化鈣的濃度變化情況來看，加入0.5%的明膠，pH 6～7，10～12.5 mmol/L氯化鈣濃度條件下，從不能形成納米粒到能形成納米粒。納米粒的形成條件向著高濃度氯化鈣的方向進行。加入明膠后，鮰魚卵肽等電點提高至pH 4.0且帶電量增加，肽分子間斥力增強，不利于肽分子的聚集。較高濃度的鈣離子可以起到電荷屏蔽作用，并在其分子之間形成鈣橋，促使其聚集成納米粒。當體系中加入1.0%和1.5%的明膠，鮰魚卵肽-鈣納米粒的形成條件也出現類似的變化趨勢，且明膠的濃度越高，變化越明顯。明膠是一種增稠劑，可以增加溶液的黏稠度，使分子內摩擦阻力增加，分子流動性下降，阻礙分子間的聚集，因此抑制納米粒的形成，導致其形成條件范圍發生改變。加入明膠后，鮰魚卵肽-鈣納米粒形成需要較高的pH以及鈣離子濃度。

圖1 明膠對鮰魚卵肽-鈣納米粒形成的影響

2.3 加熱對明膠參與形成鮰魚卵肽-鈣納米粒的影響

明膠能提高預先制備鮰魚卵肽-鈣納米粒的熱穩定性。明膠參與形成鮰魚卵肽-鈣納米粒的熱穩定性是否提高可通過以下實驗進行驗證。如表2所示，當pH為8，鮰魚卵肽-鈣納米粒加熱到50 ℃以上出現沉淀，0.5%、1.0%、1.5%明膠參與形成的納米粒，耐熱性分別達到60 ℃、70 ℃、80 ℃，耐熱性顯著增強了。如表3所示，pH為7，明膠參與形成的納米粒耐熱性增強，分別達到了60 ℃、70 ℃、80 ℃。明膠的增稠、增黏特性有效阻礙了納米粒的集聚，使納米粒的熱穩定性提高，為其產業化發展奠定了基礎。

表2 加熱對明膠鮰魚卵肽-鈣納米粒的影響（pH=8）

表3 加熱對明膠鮰魚卵肽-鈣納米粒的影響（pH=7）

3 結論

以濁度為評價指標，探究明膠對鮰魚卵肽-鈣納米粒的形成及熱穩定性的影響。鮰魚卵肽-鈣納米粒在50 ℃加熱的作用下會失穩集聚出現沉淀。在納米粒中加入0.5%、1.0%、1.5%明膠后，納米粒的耐熱性提高至60 ℃、70 ℃、80 ℃。明膠對鮰魚卵肽-鈣納米粒的形成具有抑制作用，導致其形成納米粒需要更高的pH和氯化鈣濃度。明膠參與形成的納米粒的耐熱性顯著提高。