高效液相色譜-質譜聯用儀檢測奶粉中倍他米松殘留量的方法研究

智麗慧

（上海妙可藍多食品科技股份有限公司，上海 201506）

糖皮質激素（Glucocorticoids，GCs）是一類甾體激素，又名“腎上腺皮質激素”，能夠調節(jié)糖、脂肪和蛋白質等成分的合成和代謝，臨床上廣泛應用于治療皮膚過敏性及炎癥性疾病，且糖皮質激素能提高飼料轉化率，促進動物生長而被用于動物養(yǎng)殖[1]。倍他米松作為糖皮質激素重要成員，具有消炎、抗病毒、促進泌乳等多種功效，倍他米松為地塞米松的同分異構體，作用與用途同醋酸地塞米松，其鈉水潴留作用及劑量都比后者小，在奶牛養(yǎng)殖業(yè)中被大量使用[2]。

質譜技術起源于19世紀英國學者湯普森發(fā)明的質譜儀，當時是用于檢測分子質量差異，分辨率較低；隨著質譜儀技術的提升，分辨率逐步提高，當高效液相色譜技術和質譜技術聯用后，既有高效液相色譜技術對復雜化合物的良好分離能力，又綜合了高分辨率質譜對化合物的準確定性和定量，還可在很大程度上縮減分析時間。高效液相色譜和質譜聯用技術優(yōu)勢明顯，可實現多種化合物的同時測定，檢測結果的靈敏度高、準確性好，廣泛應用于食品、藥品等檢測領域[3]。

在食品檢測行業(yè)中，高效液相色譜-質譜法可以準確高效地測定乳制品中三聚氰胺含量、農藥殘留量、獸藥殘留量、食品添加劑含量和毒素含量，其檢測速度快，定性、定量分析的準確性高，該方法補齊了常規(guī)檢測方法的短板，在食品安全檢測中的應用越來越廣，但還有很大的技術應用空間。目前，倍他米松的主要檢測方法是農業(yè)部1031號公告-2-2008《動物源性食品中糖皮質激素類藥物多殘留檢測 液相色譜-串聯質譜法》[4]。多組分同時處理時，倍他米松回收率偏低，本研究通過優(yōu)化前處理方法、色譜條件、改進標準曲線，采用高效液相色譜串聯質譜進行快速篩查，以期對乳制品中倍他米松篩查和確證提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

購買不同到貨批次的全脂奶粉20批；倍他米松標準物質（CAS：378-44-9，純度大于等于99%）；甲醇、甲酸、乙腈，均為色譜純；試驗用水為GB/T 6682—2008規(guī)定的一級水。

1.2 儀器與設備

Waters TQD型串聯四級桿質譜儀，配Waters高效液相色譜儀、自動進樣器、電噴霧離子源；Oasis HLB cartridge固相柱（3 mL/60 mg）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

使用直接稱量方式稱取1 g奶粉樣品（精確到0.01 g）于50 mL具塞離心管中，再向上述具塞離心管中加入約45 ℃ 10 mL水，漩渦1 min使奶粉樣品完全溶解成勻液。再向具塞離心管中加入20 mL乙腈，渦旋混勻1 min，以≥5 000 r/min離心10 min，使用一次性移液管取上清液至旋轉蒸發(fā)瓶中，將蒸發(fā)瓶安裝在旋轉蒸發(fā)儀上，使用45 ℃水浴減壓蒸發(fā)，將上清液濃縮至體積小于5 mL。再將濃縮后的提取液全部轉移至經活化的C18固相萃取柱，用5 mL水少量多次洗滌旋轉蒸發(fā)瓶和萃取柱，萃取柱在負壓下減壓抽干1 min，流出液全部棄去。使用5 mL乙腈作為洗脫劑，以≤3 mL/min流速進行洗脫，使用玻璃試管收集洗脫液，將玻璃試管置于45 ℃水浴中用氮氣吹干，再向玻璃試管中加入0.50 mL流動相，漩渦溶解殘渣，用0.22 μm的濾膜過濾待測定。

1.3.2 標準溶液配制

倍他米松標準儲備溶液：稱取（100±1）mg倍他米松標準物質，用甲醇進行溶解，分少量多次將溶解液體轉移到100 mL容量瓶并定容，配成濃度為1.0 mg/mL的標準儲備溶液。倍他米松標準中間工作溶液：吸取適量的倍他米松標準儲備溶液，用甲醇配成1 μg/mL標準中間工作溶液。

倍他米松標準系列工作液：分別吸取20 μL、50 μL、0.2 mL、0.5 mL、1 mL倍他米松標準中間工作溶液，用甲醇定容至100 mL，配制成濃度為0.2 μg/L、0.5 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L和10.0 μg/L的系列工作液

1.3.3 儀器條件

（1）液相色譜條件。色譜柱：XBridge C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，2.5 μm）；流動相：乙腈+0.1%甲酸溶液（1+1）；流速：200 μL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL。

（2）質譜條件。電噴霧離子源ESI+，毛細管電壓2.6 kV，離子源溫度110 ℃，錐孔反吹氣流量35 L/h，脫溶劑氣溫度300 ℃，脫溶劑氣流量750 L/h。第一重四極桿和第二重四極桿的低端分辨率及高端分辨率均為15。

2 結果與分析

2.1 提取條件的優(yōu)化

本研究比較以乙腈和乙酸乙酯為提取劑提取試樣中倍他米松。選擇4組陰性基質樣品，分別向上述4組樣品中添加2 μL、3 μL、5 μL和10 μL標準中間工作溶液制備成濃度為2 μg/kg、3 μg/kg、5 μg/kg和10 μg/kg的加標樣品，每組2個平行，分別使用乙腈和乙酸乙酯為提取劑，提取結果見表1。結果表明以乙酸乙酯為提取劑，倍他米松回收率偏低，無法達到《實驗室質量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）附錄F回收率范圍的要求[5]；以乙腈為提取劑進行提取時，由于乙腈具有使蛋白質變性的特性，提取效果好，回收率結果符合要求。故采用乙腈作為提取劑，能夠有效去除蛋白質等，有利于下一步的凈化與濃縮。

表1 不同提取劑提取倍他米松的結果對比表

2.2 線性關系

按儀器工作條件及優(yōu)化后條件對倍他米松標準系列工作液進行測定，以標準溶液濃度為橫坐標，對應的峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線。倍他米松在0.2～10.0 μg/L線性良好，線性回歸方程為y=1.336x-1.179，相關系數為0.999 7。

2.3 方法檢出限

采用經確認為陰性的基質樣品，添加一定濃度的標準溶液，樣品按照1.3方法處理并測定，以大于3倍和10倍信噪比時對應的質量濃度計算檢出限和定量限。倍他米松的檢出限為2 μg/kg，定量限為5 μg/kg。

2.4 準確性試驗

分別稱取5份奶粉樣本，1份作為試樣本底，分別在另外4份中添加不同量倍他米松標準溶液，制備成理論添加量分別為2 μg/kg、3 μg/kg、5 μg/kg和10 μg/kg的加標樣品，對5份試樣測定，方法的平均回收率為65.0%～86.0%，方法回收率在60%以上，可滿足檢測要求，結果見表2。

表2 倍他米松加標回收率結果

2.5 精密度試驗

選取倍他米松未檢出的陰性試樣，按照1.3.1方法稱取24份試樣，分為4組，每組6個平行，每組添加不同濃度的標準溶液，進行測定，相對標準偏差為3.29%～13.76%，方法的精密度在15%以內，可滿足檢測要求，結果見表3。

表3 精密度試驗結果

2.6 實際樣品的測定

對20批奶粉樣品用優(yōu)化后方法進行檢測，同時附帶加標回收的質量控制方式，在回收率符合的情況下，奶粉試樣結果均未檢出。

3 結論與討論

本文建立了奶粉中倍他米松的高效液相色譜-質譜檢測法。基于《牛奶和奶粉中地塞米松殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》（GB/T 22978—2008）[6]的前處理步驟，該方法優(yōu)化了前處理條件，使用乙腈作為提取劑，檢出限和定量限均符合國家標準要求，曲線線性表現良好，回收率和精密度也均符合國家標準要求，同時應用奶粉實際樣品檢測過程未發(fā)現異常。因此，該方法可適用于奶粉中倍他米松的篩查測定；另外該方法應用的提取劑與測定奶粉中地塞米松殘留量的提取劑一致，可進一步擴展應用奶粉中地塞米松和倍他米松的同時測定。