石榴葉和甘薯葉提取物的抗菌活性研究

周中馳，徐志龍，陳學紅，姜金晨，孫會剛

（徐州工程學院 食品與生物工程學院，江蘇徐州 221018）

近年來，隨著農藥學、植物病理學和分子生物學等學科的迅速發展以及學科相互交融，植物源殺菌劑的研究開發取得了極大進步，包括抑菌活性成分的分析、作用方式和抑菌機理研究、抑菌譜和應用效果研究等[1]。開發天然、高效、安全、無毒、性能穩定、價格優惠和廣泛適應環境的天然防腐劑已成為現代食品科學技術研究及其應用的一個重要熱點。石榴葉和甘薯葉本身含有大量的活性抗菌物質，加快開發與利用石榴葉和甘薯葉，不僅可以有效減少資源浪費，還能有效降低天然抑菌劑價格，同時還能為我國天然抑菌劑提供新的來源。

石榴葉為石榴科石榴屬植物石榴的葉子，具有清熱燥濕、澀腸等功效。近年來，通過對石榴葉成分的分析，發現了30多種化合物，其中多酚類和黃酮類物質是石榴葉的主要功能性成分，可以作為抗真菌劑、抗生素、止血劑、殺寄生蟲藥使用。相比于維他命C、蘆丁等物質，石榴葉提取物表現出更好的自由基清除能力及抗氧化活性。馮珍鴿等[2]使用索氏提取法以甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯為提取溶劑，對番石榴葉進行提取，確定最佳提取條件為甲醇、乙醇、正丁醇分別在料液比為1∶16，提取時間為5 h時，番石榴葉提取液最佳；乙酸乙酯在料液比為1∶18、提取時間為5 h時，番石榴葉提取液最佳，并對所提得的番石榴葉提取液進行抑菌實驗，結果表明番石榴葉提取物有較強的抗菌活性。王紅妹等[3]選取了石榴9個不同部位進行研究，用抑菌圈法測定各部位的抑菌活性，研究結果表明石榴葉、石榴皮、酸石榴籽為有效抑菌部位，具有一定的研究開發價值。

甘薯葉中含有多種營養成分且富含多種活性多糖、黃酮類化合物和綠原酸。綠原酸是通過咖啡酸與奎尼酸生成的縮酚酸，是植物體在有氧呼吸過程中經過莽草酸途徑產生的一種苯丙素類化合物，綠原酸具有多種生物活性[4-5]。蘇萌萌等[6]用雞肉腐敗菌熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌作為指示菌，通過測量經過綠原酸處理前后細胞外的ATP和蛋白質質量濃度，并使用掃描電鏡觀察和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察指示菌經過綠原酸處理前后細胞膜的變化，說明綠原酸是通過作用于細胞膜，使細胞膜受損嚴重，導致膜電位被破壞，胞內大分子物質泄漏，從而達到抑菌作用。張鞍靈等[7]發現綠原酸具有抗氧化、抗菌、抗病毒作用；向國昌等[8]采用了浸提法、超聲波法、浸提法加超聲波法、傳統水煎法和乙醇回流法等5種方法對甘薯葉中的綠原酸進行提取，并通過多種方法比較，發現最適合甘薯葉、莖中綠原酸提取的方法是浸提法和超聲波法的綜合使用，最佳提取條件是pH為4，提取溶液為50%的甲醇或乙醇，浸提時間為24 h，超聲時間為1.0～1.5 h，溫度為40 ℃。

由于石榴葉活性抗菌物質和甘薯葉活性抗菌物質都能被甲醇、乙醇等極性有機溶劑所提取，而且甲醇極性比乙醇大，更容易提取到所需的活性抗菌物質，故本實驗將以甲醇作為提取溶劑。

1 材料與方法

1.1 原料

石榴葉，產地為廣東省揭陽市；甘薯葉，產地為福建省漳州市。

1.2 指示菌種與試劑

細菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），均為徐州工程學院生物芯片實驗室保藏菌種；甲醇；LB培養基；肉湯瓊脂培養基；枯草芽孢桿菌常用培養基；瓊脂等。

1.3 主要儀器

SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；FA2140N電子天平，上海精密科學儀器有限公司；HPX-16085H-Ⅲ恒溫恒濕箱，上海新苗醫療器械制造有限公司；303-1電熱恒溫培養，紹興市銀河機械儀器有限公司；KQ5200DE數控超聲波清洗器，德國Christ公司；RE-2000B旋轉蒸發器，上海亞榮生化有限公司；SH-Ⅲ型循環真空泵，上海亞榮生化有限公司；250 mL規格提取筒，江蘇匯達醫療器械有限公司；250 mL規格蛇形冷凝管，江蘇匯達醫療器械有限公司；立式高壓蒸汽滅菌鍋，日本Tomy Digital Biology公司等。

1.4 實驗方法

1.4.1 石榴葉抑菌活性物質的提取

石榴葉清洗后烘干至恒重后，用粉碎機粉碎成粉，過50目篩。稱取5 g石榴葉粉末，倒入已折好的濾紙包中，組裝好索氏提取器，將濾紙包放入提取筒中，在提取筒里倒入100 mL甲醇，使甲醇能超過一次虹吸管，溫度設置在80 ℃，回流萃取5 h。將原料的提取液放入旋轉式蒸發器中，溫度50 ℃，將提取液進行蒸發濃縮至25 mL，得到原液。

1.4.2 甘薯葉抑菌活性物質的提取

甘薯葉清洗后烘干至恒重，用粉碎機粉碎成粉，過50目篩。稱取2 g甘薯葉粉末，加入200 mL濃度為50%的甲醇，在室溫下靜置24 h，放入超聲波清洗器中，溫度為40 ℃，時間為60 min，功率設置在80 W進行超聲波提取。待原料提取完成后，將提取液進行抽濾，將濾液于旋轉蒸發儀中，在溫度為50 ℃下濃縮至10 mL，得到原液。

1.4.3 指示菌的活化

將保藏的4種指示菌接種于相應培養基進行活化，其中金黃色葡萄球菌、大腸桿菌使用LB培養基進行培養，蠟樣芽孢桿菌使用肉湯瓊脂培養基進行培養，枯草芽孢桿菌使用枯草芽孢桿菌常用培養基進行培養，37 ℃培養24 h，然后挑選生長狀況較好的菌落接入新的培養基上，重復進行上述步驟3次，從而得到生長良好的菌落，然后挑選生長狀況較好的菌落各接入相應的液體培養基，放于搖床中37 ℃培養12 h后，取出備用。

1.4.4 抑菌實驗

在無菌環境下，用生理鹽水將4種指示菌液的濃度分別稀釋為10-1、10-2、10-3和10-4，分別吸取100 μL 10-3、10-4濃度的菌液并滴加在相應的培養基上并涂布均勻，其中大腸桿菌菌液和金黃色葡萄球菌菌液滴加在LB培養基上，枯草芽孢桿菌菌液滴加在枯草芽孢桿菌常用培養基上，蠟樣芽孢桿菌菌液滴加在肉湯瓊脂培養基上。然后將直徑為1 cm的打孔器在酒精燈的火焰上燒熱滅菌，冷卻后，在每個培養基上各打3個孔，分別注射200 μL的甘薯葉活性抑菌物質提取液、石榴葉活性抑菌物質提取液和無菌水，且將甘薯葉活性抑菌物質的提取液和石榴葉活性抑菌物質的提取液按照1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2和9∶1的比例分別進行復配，同時培養基所打孔中注射的活性抑菌液為按以上的比例混合均勻的復配液，37 ℃恒溫恒濕培養箱中培養18 h，觀察抑菌效果并測量抑菌圈的直徑。重復實驗3次，取平均值。

2 結果與分析

由表1可知，抑菌液中僅甘薯葉提取物對枯草芽孢桿菌無抑菌效果，其余提取液均有抑菌效果，且石榴葉提取液的抑菌圈均大于甘薯葉提取液。當復配液為4∶6時，僅對大腸桿菌有最大的抑菌圈，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌的抑菌圈直徑均小于石榴葉提取液的抑菌圈，而當復配液比例為2∶8時，其對于4種指示菌的抑菌圈均大于石榴葉提取液的抑菌圈。表1所有抑菌液中甘薯葉提取液∶石榴葉提取液比例為2∶8復配液具有最佳的抑菌效果。

表1 不同種類提取液對供試菌種的抑菌圈直徑（單位：cm）

3 結論

本實驗表明了抑菌活性大小順序為甘薯葉提取液∶石榴葉提取液比例為2∶8復配液＞石榴葉提取液＞甘薯葉提取液。由于本實驗所用指示菌為常見的食品加工污染菌，故對植物源防腐劑的研發具有一定的意義。但要將石榴葉與甘薯葉的活性抗菌物質提取液應用到食品防腐上時，由于蒸發濃縮時不能保證甲醇完全被蒸發，而且甲醇對人體有危害，應將提取溶劑換為對人體危害小且提取效果相似的其他溶劑。