吡喃酮對黑土微生物群落結構的影響

司馬鑫琪，鐘佳輝，張延慧，譚怡穎，王 江，楊雪芳，孫大生

（1.山西農業大學 資源環境學院，山西 太谷 030801；2.中國科學院大學 現代農業科學學院，北京 100049；3.南京林業大學 林學院，江蘇 南京 210037；4.山西農業大學 農學院，山西 太谷 030801）

雜草是作物減產的主要生物因素。據統計，世界范圍內雜草能夠造成作物平均減產34%，每年我國由于雜草所損失的作物產量在10%以上[1]。20世紀40年代，2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的引入徹底改變了農業，開啟了化學除草的時代。化學除草劑目前仍是控制雜草最直接有效的方式，但除草劑使用不合理不僅不能控制田間雜草，更有可能產生藥害[2]，而且化學除草劑的使用會帶來環境安全等問題，甚至還會引起環境污染，危害人畜健康[3-4]。因此，安全有效防控農田雜草變得日益迫切。

目前，越來越多的研究集中于雜草的綜合防治，利用植物化感作用開發除草劑來防除雜草就是其中一個理念[5]。研究發現，麥黃酮的一類衍生物吡喃酮具有高效的除草活性，可選擇性地殺滅田間雜草而不傷害農作物[6]，其除草機理與內吸性除草劑2，4-D相似。吡喃酮可引起雜草激素代謝紊亂，同時，其施入土壤后釋放緩慢，藥效比2，4-D持久[6]。土壤微生物在陸地生態系統中具有重要作用，負責調節土壤養分的生物地球化學循環，促進植物生長，維持生態系統的穩定[7]。土壤中微生物群落對環境因素變化十分敏感，因此，土壤微生物群落多樣性及群落結構的研究是揭示土壤質量狀況的基礎[8-9]。故一般通過不同劑量農藥對土壤中微生物群落結構和多樣性等方面的研究來確定除草劑對土壤微生物的影響，為評價除草劑對土壤環境的生態風險提供了指導。

吡喃酮雖然作為化感物質衍生物，能夠抑制雜草生長并對作物安全[10]，然而，目前對于吡喃酮對土壤微生物影響程度尚不清楚，在投入生產使用前，評價其對土壤微生物群落結構的影響是安全使用的重要前提。

東北黑土區是我國重要的商品糧基地，在國家糧食安全戰略中發揮著重大的作用。新型除草劑吡喃酮的使用有望進一步提高東北黑土區的糧食產量，但目前對于吡喃酮的廣泛使用是否存在威脅微生物群落安全的風險還有待進一步研究。因此，本研究選用我國北方典型黑土作為研究對象，通過室內模擬試驗，采用高通量測序技術分析吡喃酮對黑土微生物群落結構的影響，以期為吡喃酮的安全使用以及黑土區農田生態系統安全提供一定理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試藥劑為化感物質衍生物3-[2-(2-氯-4-氟苯氧基)乙酰基]-4-羥基-6-甲基-2-氫-吡喃-2-酮(簡稱吡喃酮)，以麥黃酮為前體自行合成。

供試土壤類型為黑土，采自黑龍江省哈爾濱市延壽縣玉合鄉河心村(N45.39°,E128.38°)。供試土壤化學性質為pH值6.64，有機質37.31 g/kg，堿解氮114.44 mg/kg，有效磷45.98 mg/kg，速效鉀135.66 mg/kg，全 氮3.38 g/kg，全 磷0.8174 g/kg，全鉀26.49 g/kg。

1.2 試驗設計

試驗在山西農業大學資源環境學院礦區復墾與微生物多樣性研究室進行。稱取3份900 g過2 mm篩的風干土，調節含水量至40%WHC（土壤持水量），25℃預培養7 d。用丙酮作為溶劑配制0.25 mg/mL和2.5 mg/mL的吡喃酮溶液，將1 mL上述溶液和丙酮溶劑分別加到100 g過0.154 mm篩的細土中，迅速混勻，待丙酮揮發后，將細土與預培養土樣按質量比1∶10均勻混合，最后用蒸餾水調節含水量至50%WHC，從而得到吡喃酮添加量分別為0（CK）、0.25 mg/kg（低質量分數）、2.5 mg/kg（高質量分數）的土樣，其中，0.25 mg/kg為推薦劑量，2.5 mg/kg用以評估土壤受到不可控的吡喃酮污染時土壤微生物的響應。將土樣于25℃避光培養，并于第7、60天時取樣測定，7 d模擬短期藥劑施用效果，60 d模擬長期藥劑施用效果，每個處理重復3次。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 DNA提取 將3個處理的新鮮土樣經過冷凍干燥后，稱取0.5 g，使用FaStDNA SpinKit for soil（MP Biomdecals，LLC）試 劑 盒 提 取 土 壤DNA。

1.3.2 測序分析 提取的總DNA濃度和質量用分光光度計測定（Nano Drop2000，Thermo Scientific，Wilmington，DE，USA）。16S rRNA擴增引物對為：V 3+V 4區域（428 bp）引物（上游引物為5'-CCTAC GGGNGGCWGCAG-3'，下游引物為5'-GACTAC HVGGGTATCTAATCC-3'）和 真 菌ITS1區 域（187-298）引物（上游引物為5'-CTTGGTCATTT AGAGGAAGTAA-3'，下游引物為5'-GCTGCGT TCTTCATCGATGC-3'）。運用FLASH軟件對原始DNA片段進行讀取整合，進一步用USEARCH v5.2.32軟件對序列進行過濾除噪，并且將非相似程度小于3%的序列進行聚類，形成可操作分類單元（OTU）。委托諾和致源生物科技股份有限公司就土壤微生物多樣性測定與分析等項目進行專項技術服務。

1.4 數據分析

利用Microsoft Excel 2010對多樣性指數和相對豐度數據進行處理，利用SPSS 19.0軟件對各處理間的指標差異顯著性進行分析。利用Origin 2021軟件繪制主要優勢細菌和真菌在門和屬水平的相對豐度。基于OTU水平計算微生物的豐富度指數（Shannon指數）和多樣性指數（Chao1指數），計算公式如下：

式中，Sobs表示實際觀測到的OTU數；n1表示只有1條序列的OTU數目，n2表示只有2條序列的OTU數目；ni表示第i個OTU所含的序列數；N表示所有序列數。

2 結果與分析

2.1 樣品中所含OTU數目分析

97%序列相似度下對3個處理的黑土細菌和真菌OTU進行歸并和劃分，繪制Venn圖。圖1展示了各處理共有和特有的OTU數，以及OTU的重疊情況。從圖1可以看出，培養7 d后，0、0.25、2.50 mg/kg共3個吡喃酮處理下黑土細菌的OTUs總數分別為5 302、5 081、4 936個，特有的OTU的數目分別是808、624、520個，各組樣品中共同檢測到的OTUs數目為3 479個。至60 d時，0、0.25、2.50 mg/kg 3個處理下細菌的OTUs總數分別為4 789、4 884、5 384個，特有的OTU數目分別為427、473、846個，各組樣品中共同檢測到OTUs數目為3 431個。

培養7 d后，0、0.25、2.50 mg/kg等3個吡喃酮處理下黑土真菌的OTUs總數分別為1 044、1 019、939個，特有的OTU的數目分別是183、150、124個，各組樣品中共同檢測到OTUs數目為651個。至60 d時，0、0.25、2.50 mg/kg等3個處理下黑土真菌的OTUs總數分別為836、848、929個，特有的OTU的數目分別是89、115、166個，各組樣品中共同檢測到OTUs數目為579個。

2.2 不同質量分數吡喃酮處理對黑土細菌和真菌群落多樣性的影響

從圖2可以看出，吡喃酮處理7 d后細菌群落Shannon指數和Chao1指數分別為9.29～9.34和3 842～3 891，真菌群落Shannon和Chao1指數分別為5.58～5.63和729～682；60 d后，細菌群落Shannon和Chao1指數分別為9.64～9.69和3 841～4 143，真菌群落Shannon和Chao1指數分別為5.51～5.74和654～702。與CK相比，0.25、2.50 mg/kg吡喃酮處理 對細菌、真菌群落Shannon和Chao1指數無顯著影響。

2.3 不同質量分數吡喃酮處理對黑土細菌和真菌群落組成的影響

2.3.1 不同質量分數吡喃酮處理對黑土細菌門水平相對豐度的影響 由圖3可知，黑土相對豐度＞10%的優勢細菌門有變形菌門（Proteobacteria，Pro）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes，Gem）、放線菌門（Actinobacteria，Act）和酸桿菌門（Acidobacteria，Aci），其余相對豐度高于1%的細菌門還有綠彎菌門（Chloroflexi，Chl）、厚壁菌門（Firmicutes，Fir）、擬桿菌門（Bacteroidetes，Bac）、疣微菌門（Verrucomicrobia，Ver）、浮霉菌門(Planctomycetes，Pla）、奇古菌門（Thaumarchaeota，Tha）。培養7 d與對照 相比，2.5 mg/kg高質量分數吡喃酮處理顯著提升了綠彎菌門的相對豐度，增幅為30.3%，但對其他優勢菌門無顯著影響；至60 d時，高質量分數吡喃酮處理的綠彎菌門相對豐度與對照相比無顯著差異。培養過程中，低質量分數吡喃酮對細菌門相對豐度無顯著影響。

2.3.2 不同質量分數吡喃酮處理對黑土細菌屬水平相對豐度的影響 由圖4可知，供試土壤前11個優勢細菌屬為鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas，Sph）、芽孢桿菌屬（Gemmatimonas，Gem）、假單胞菌屬（Pseudomonas，Pse）、不明γ菌（unidentified_Gammaproteobacteria，u_Gam）、不明酸桿菌（unidentified_Acidobacteriau，u_Aci）、不動桿菌屬（Acinetobacter，Aci）、Haliangium（Hal）、Gemmatirosa（Gem）、尿桿念珠菌屬（Candidatus_Udaeobacter，c_Uda）、溶桿菌屬（Lysobacte，Lys）、氮水單胞菌屬（Azohy-dromonas，Azo）。處 理7、60d后，芽 孢 桿 菌 屬（Gemmatimonas）的相對豐度均要比Gemmatirosa相對豐度高。與CK相比，處理7 d時2.5 mg/kg吡喃酮處理顯著提高了鞘氨醇單胞菌屬的相對豐度，增幅35.5%；處理60 d后，2個處理的鞘氨醇單胞菌屬相對豐度無顯著差異。低質量分數吡喃酮對其他優勢菌屬無顯著影響。高質量分數吡喃酮處理60 d時，與CK相比顯著降低優勢菌屬鞘氨醇單胞菌屬和Haliangium的相對豐度，降幅分別為12.6%和37.0%。

2.3.3 不同質量分數吡喃酮處理對黑土真菌門水平相對豐度的影響 由圖5可知，供試土壤的前4個優勢真菌門為子囊菌門（Ascomycota，Asc）、被孢霉門（Mortierellomycota，Mor）、擔子菌門（Basidiomycota，Bas）和壺菌門（Chytridiomycota，Chy），其中，子囊菌門是最大的優勢真菌門。與對照相比，低質量分數和高質量分數吡喃酮處理7 d顯著降低了子囊菌門的相對豐度，降幅分別為20.8%和25.9%，但處理60 d后，低質量分數和高質量分數吡喃酮處理的子囊菌門相對豐度與對照相比無顯著差異。吡喃酮處理對其他優勢菌門均無顯著影響。

2.3.4 不同質量分數吡喃酮處理對黑土真菌屬水平相對豐度的影響 由圖6可知，供試土壤的優勢真菌屬分別為鐮刀菌屬（Fusarium，Fus）、黃色籃狀菌 屬（Talaromyces，Tal）、腐 質 霉 屬（Humicola，Hum）、曲 霉 屬（Aspergillus，Asp）、葡 萄 穗 霉 屬（Stachybotrys，Sta）、假雨盤菌屬（Pseudombrophila，Pse）、毛殼菌屬（Chaetomium，Cha）、Minimedusa（Min）、Solicoccozyma（Sol）和Sagenomella（Sag）。與對照相比，低質量分數處理7、60 d顯著提高了葡萄穗霉屬的相對豐度，增幅為34.7%。低質量分數處理60 d顯著提高了供試黑土的鐮刀菌屬相對豐度（41.1%），顯著降低了籃狀菌屬的相對豐度（72.0%）。高質量分數處理60 d顯著提高了鐮刀菌屬和葡萄穗霉屬的相對豐度，增幅分別為51.9%和60.1%，但對其他優勢真菌屬無顯著影響。

3 討論

3.1 吡喃酮對細菌群落結構的影響

細菌多樣性和豐富度是評價除草劑對土壤細菌群落結構影響的重要指標。許艷蕊等[11]研究發現，除草劑使它隆處理玉米土壤10 d后降低了細菌群落多樣性和豐度，而處理60 d后細菌群落的多樣性和豐度提高。姚斌等[12]研究發現，除草劑阿特拉津處理7 d細菌群落多樣性顯著低于對照，而處理60 d后，多樣性有所恢復。2，4-D對細菌群落的影響與藥劑濃度有較高的相關性，在100倍田間濃度下，細菌生長明顯受到抑制，至培養結束仍顯著低于對照水平[13]。吡喃酮與2，4-D具有相似的殺草原理，本研究表明，低質量分數和高質量分數吡喃酮對供試土壤細菌群落的Chao1和Shannon指數無顯著影響，表明正常噴施甚至高質量分數吡喃酮污染等極端情況對供試黑土的細菌多樣性也不會造成危害。

大量研究表明，除草劑施入土壤后會引起土壤微生物組成的變化，且對不同菌群的影響程度不一。杜慧玲等[14]研究表明，不同濃度的2，4-D處理對細菌生長呈極顯著的抑制效應，隨濃度提高，抑制效果增強。許艷蕊等[11]研究發現，除草劑使它隆會導致細菌群落組成發生明顯變化，使它隆處理10 d后酸桿菌門相對豐度提高了30.8%，放線菌門和綠彎菌門相對豐度分別降低了24.4%和25.6%；使它隆處理60 d后變形菌門和綠彎菌門相對豐度仍低于對照水平。有研究表明，變形菌門細菌可以參與土壤氮磷循環，從而起到改善土壤環境的作用[15]。本研究表明，在細菌門水平上，高質量分數處理7 d后顯著提升了綠彎菌門的相對豐度，增幅為30.3%，但處理60 d后恢復至對照水平。研究發現，綠彎菌門與群落中的其他微生物存在密切的互作[16-17]，可以吸收同化環境中生物和非生物來源的多種有機酸物質，參與有機鹵化物降解[18]，對維持生態環境動態平衡有著積極作用。吳靜等[19]進一步從屬水平上分析發現，草甘膦對土樣中細菌群落屬水平上的組成影響顯著，草甘膦處理6 d后Acidobacteriales norank相對豐度提高了87.4%，未培養型黃單胞菌屬Xanththobacteraceae uncultured相對豐度降低41.5%；草甘膦處理12 d后Subgroup6 norank相對豐度降低了48.1%，未培養型芽單胞菌屬相對豐度提高了91.2%。本試驗結果發現，吡喃酮對細菌屬水平組成有一定影響，但與吳靜[19]等的研究結果不同，低質量分數吡喃酮處理7 d顯著提高了鞘氨醇單胞菌屬的相對豐度，增幅為35.5%，到60 d時恢復至對照水平；高質量分數吡喃酮處理7 d時，優勢菌屬與對照相比無顯著差異，處理60 d顯著降低了鞘氨醇單胞菌屬和Haliangium的相對豐度，降幅分別為12.6%和37.0%。有研究發現，鞘氨醇單胞菌屬對土壤污染有修復作用[20]，低濃度吡喃酮加入土樣可能對鞘氨醇單胞菌屬起激活作用而提高其相對豐度，隨時間的延長，吡喃酮逐漸降解，鞘氨醇單胞菌屬的相對豐度也就逐漸下降；低濃度吡喃酮加入土樣刺激其他微生物，使之其相對豐度提高，微生物之間競爭作用導致Haliangium相對豐度降低[21]。本研究的高低2個水平吡喃酮處理對細菌群落并沒有表現出明顯的抑制效果。

3.2 吡喃酮對真菌群落結構的影響

除草劑對真菌群落結構的影響是評價除草劑安全性的一個重要方面。張雯雯等[22]研究發現，低濃度芐嘧磺隆處理對土壤真菌群落多樣性有促進作用，處理14 d后促進作用消失，處理28 d后多樣性顯著降低；高濃度芐嘧磺隆處理（除第1 d）使土壤真菌群落多樣性持續顯著降低。陶波等[23]研究發現，低濃度草甘膦處理對真菌群落的影響不顯著；高濃度草甘膦處理對真菌群落則有明顯的抑制作用，隨時間的延長種群數量有一定恢復。鄧曉等[24]研究發現，0.05～5 mg/kg的百草枯處理2 d時抑制率達14.5%～82.4%，30 d內嚴重抑制真菌種群。上述研究表明，主流商品除草劑均會一定程度上影響土壤真菌群落。相反本試驗發現，低質量分數和高質量分數吡喃酮處理對黑土真菌群落的多樣性和豐富度的影響均不顯著，因而表現出更強的安全性。

吳靜等[19]研究發現，草甘膦對真菌群落組成的影響與處理時間密切相關，推薦劑量的草甘膦處理6 d后子囊菌門相對豐度下降了14.6%，擔子菌門相對豐度提高了39.8%；處理12 d后毛霉菌相對豐度持續增加，Uncalsstidied相對豐度持續減少。陶波等[23]研究發現，草甘膦對真菌群落組成的影響與藥劑濃度具有較高相關性，低濃度草甘膦處理會抑制真菌群落，但真菌群落對低濃度的草甘膦處理具有較快的適應性，而高濃度草甘膦處理下真菌群落就不能恢復。杜慧玲等[13]研究發現，高質量濃度（50 mg/kg）2，4-D處理3 d對真菌群落表現為激活效應，激活率可達33.9%～109.1%，處理7～60 d則表現為抑制作用，60 d后真菌數量僅為對照的55.4%；低質量分數（10 mg/kg）2，4-D處理對真菌群落也表現為抑制作用，隨時間的延長，抑制效果減弱。本試驗研究發現，高低2個水平吡喃酮處理后都會導致子囊菌門相對豐度顯著下降，但在60 d后這種抑制效果消失。陶波等[23]研究發現，從屬水平上，在10、20 mg/kg的低質量分數草甘膦會激活土壤中的鐮刀菌屬，50～500 mg/kg的高質量分數處理下則表現為明顯的抑制作用。ZOBIOLE等[25]研究也發現，草甘膦會導致鐮刀菌屬的增殖。本試驗也發現，2個處理60 d顯著提高了供試黑土的鐮刀菌屬相對豐度，且顯著降低了籃狀菌屬的相對豐度，低質量分數處理7、60 d及高質量分數處理60 d均顯著提高了葡萄穗霉屬的相對豐度。這可能是由于吡喃酮對鐮刀菌屬和葡萄穗霉菌屬有激活作用，可被其作為代謝底物。因此，長期（60 d）來看，按推薦濃度正常施用吡喃酮具有較高的安全性。

4 結論

本研究表明，吡喃酮對黑土微生物豐富度和多樣性無顯著影響，吡喃酮對黑土大部分優勢菌門、菌屬均無顯著影響。培養7 d后，低質量分數吡喃酮處理顯著降低了真菌子囊菌門的相對豐度；高質量分數吡喃酮處理顯著提高了細菌綠彎菌門相對豐度，顯著降低了真菌子囊菌門的相對豐度，培養60 d后恢復至對照水平。至培養結束，低質量分數吡喃酮對真菌葡萄穗霉屬、鐮刀菌屬表現為刺激作用。高質量分數吡喃酮對細菌鞘氨醇單胞菌屬、細菌Haliangiu和真菌籃狀菌屬表現抑制作用。總體而言，低質量分數吡喃酮雖會短時間內改變部分菌群的相對豐度，但隨著培養時間延長其作用消失，表明吡喃酮對黑土微生物群落結構具有較高的安全性。