新鮮枸杞葉中黃酮提取工藝的優化及抗氧化性分析

繆文玉，李冠文，殷孝瑩，秦 楠

（1.太原城市職業技術學院 管理工程系，山西 太原 030027；2.山西中醫藥大學 中藥與食品工程學院，山西 晉中 030619）

寧夏枸杞是中國藥典中最好的唯一藥用品種，其根、葉、花、果實均可入藥。枸杞葉（Lycium barbarumleaves）是茄科枸杞屬植物枸杞（LyciumbarbarumL.）的嫩葉，其性味苦、甘、澀，具有補腎益精、清熱明目、延緩衰老等功效[1]。現代研究表明，枸杞葉藥理作用復雜多樣，主要有抗衰老[2]、降血糖、降血脂[3-4]、抗炎鎮痛、抑菌、抗氧化[5-6]等作用且從枸杞葉化學成分來看，其所含活性成分有生物堿、黃酮、多糖、酚類、蛋白質、脂肪、氨基酸、微量元素以及萜類化合物等，其中，以多糖類以及黃酮類化合物的含量較高，因而現代學者對枸杞葉中這2種化合物的研究較為廣泛。崔今[7]通過高效液相色譜-質譜法（HPLC-MS法）對枸杞葉干藥材提取物進行鑒定，研究表明，枸杞葉提取物是由11種黃酮類化合物組成，且藥理作用研究發現黃酮提取物可以達到顯著的降血糖效果。范艷麗等[8]的研究結果證實了枸杞葉干藥材黃酮提取物對超氧陰離子、·OH、DPPH、亞硝基以及ABTS自由基具有顯著的清除能力，因而得出黃酮提取物是天然的氧化劑的初步結論。呂海英等[9]研究發現，黑果枸杞葉中的黃酮類化合物具有顯著的抗衰老、降血脂作用，推測可能與其中的蘆丁、槲皮素、木犀草素、異鼠李素及山奈素成分的含量息息相關。干藥材枸杞葉中富含較多活性成分且具有豐富的藥理作用，為本試驗研究新鮮枸杞葉活性成分及抗氧化活性奠定了堅實了理論基礎。

枸杞葉黃酮類成分的提取以往大多采用有機溶劑提取法，該法存在有機溶劑消耗量大、回流時間長等缺點，而近幾年新興起的超聲波輔助酶解提取法具有耗時短、酶解速度快、操作簡便等特點，因此，本試驗選用該提取法進行研究。目前，國內外對中藥材枸杞屬枸杞的化學成分、藥理作用等研究主要集中在不同品種枸杞子以及黑果枸杞葉等，對寧夏枸杞葉研究多為干燥枸杞葉而對新鮮寧夏枸杞葉沒有相關研究。新鮮枸杞葉廉價易得、無任何前處理操作，可有效減少有效成分的損失。因此，本試驗以新鮮寧夏枸杞葉為原材料，利用超聲波輔助酶解法手段提取枸杞葉中總黃酮，并通過BoXbenhnken設計分析得到最佳提取工藝參數，在此基礎上初步探討新鮮枸杞葉黃酮提取液的抗氧化活性，旨在為新鮮枸杞葉的綜合利用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及試劑

新鮮枸杞葉采摘于寧夏枸杞種植基地。蘆丁標準品（≥98%）（上海融禾醫藥科技發展有限公司）；纖維素酶（鄭州宇控生物科技有限公司）；無水乙醇（AR）、硫酸亞鐵（AR）、水楊酸（AR）、過硫酸鉀（AR）、30%過氧化氫（天津市天力化學試劑有限公司）；硝酸鋁（AR）、亞硝酸鈉（AR）（山東西亞化學工業有限公司）；氫氧化鈉（天津市東麗區南孫莊村西工業區）；Vc、·OH、DPPH、ABTS（純度均＞99%）（北京奧博星生物技術有限責任公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 超聲波輔助酶解法提取黃酮化合物 將新鮮枸杞葉洗凈、干燥、粉碎，精密稱取約1.0 g枸杞葉粉末，加入16 mg纖維素酶混合均勻，加入30 mL 60%乙醇溶液后調節pH值至5.0，置于40℃水浴鍋中酶解30 min，然后將其轉移至超聲波清洗機中于超聲溫度50℃、超聲功率500 W條件下超聲提取30 min，抽濾。所得濾餅按照上述操作再次提取后合并2次濾液，最后定容至1 000 mL容量瓶中備用（圖1）。

1.2.2 超聲波輔助酶解法的單因素試驗

1.2.2.1 超聲溫度對新鮮枸杞葉黃酮提取率的影響 按照1.2.1步驟操作，固定料液比1∶20、乙醇體積分數60%、超聲功率500 W，考察不同超聲溫度（30、40、50、60、70℃）提取條件下對枸杞葉總黃酮提取率的影響。

1.2.2.2 超聲功率對新鮮枸杞葉黃酮提取率的影響 按照1.2.1步驟操作，固定超聲溫度50℃、料液比1∶20、乙醇體積分數60%，考察不同超聲功率（100、200、300、400、500 W）提取條件下對枸杞葉總黃酮提取率的影響。

1.2.2.3 乙醇體積分數對新鮮枸杞葉黃酮提取率的影響 按照1.2.1步驟操作，固定超聲溫度50℃、料液比1∶20、超聲功率500 W，考察不同乙醇體積分數（55%、60%、65%、70%、75%）提取條件下對枸杞葉總黃酮提取率的影響。

1.2.2.4 料液比對新鮮枸杞葉黃酮提取率的影響 按照1.2.1的步驟操作，固定超聲溫度50℃、乙醇體積分數60%、超聲功率500 W，考察不同料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）提取條件下對枸杞葉總黃酮提取率的影響。

1.2.3 響應曲面設計 按照Box-benhnken中心組合試驗設計原理，在單因素試驗的基礎上，以考察新鮮枸杞葉中黃酮提取率（Y）為最終目的，選定超聲溫度（A）、超聲功率（B）、乙醇體積分數（C）、料液比（D）共4個因素進行4因素3水平共27個試驗點的響應曲面設計，各因素水平如表1所示。

表1 響應曲面試驗設計的因素與水平Tab.1 Design factors and level s of response surface test

1.2.4 蘆丁標準曲線的制作及黃酮提取率的計算 參照丁建海等[10]的蘆丁標準曲線建立方法，在400～600 nm波長下確定黃酮化合物的最大吸收波長，在最大吸收波長下繪制蘆丁標準曲線。準確量取新鮮枸杞葉黃酮提取液1 mL，按照蘆丁標準曲線操作方法測定吸光度A值，計算黃酮提取率。

式中，W表示新鮮枸杞葉中黃酮提取率（%）；C表示新鮮枸杞葉黃酮提取液的質量濃度（mg/mL）；V1表示新鮮枸杞葉黃酮提取液的體積（mL）；V2表示稀釋倍數；m表示藥材取樣量（mg）。

1.2.5 黃酮提取液的抗氧化性研究 按上述最佳制備工藝所得的黃酮提取液濃縮至恒質量，稱取5 mg放于燒杯中，用適量65%乙醇溶解后轉移至10 mL容量瓶中，定容至刻度線即可得到5 mg/mL的樣品溶液。取3 mL該樣品溶液于4個不同容量瓶中用65%乙醇分別稀釋至15.0、7.5、5.0、3.75 mL，即可得到質量濃度分別為1、2、3、4 mg/mL的樣品溶液。將上述5個不同質量濃度樣品溶液采用段亞云等[11]的方法進行DPPH自由基的清除活性測定；采用鄭朝華等[12]的方法進行OH自由基的清除活性測定；采用何蘭香等[13]的方法進行ABTS自由基的清除活性測定。

1.3 數據處理

本試驗數據采用SPSS 22.0和Design-Expert V 8.0.6統計軟件分析，應用最小差異顯著法（LSD）進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線的繪制

試驗結果（圖2）顯示，新鮮枸杞葉黃酮提取液的適宜檢測波長為510 nm，且當蘆丁質量濃度在0～0.6 mg/mL時，濃度（X）與吸光度值（Y）的線性相關程度最好，線性方程為y=14.684x+0.028 1（R2=0.990 1），R2接近于1，表明在此區間y與x表現出較好的等比增長關系，適宜用此方程式進行后續樣品濃度的換算。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 超聲溫度對新鮮枸杞葉黃酮提取率的影響 由圖3可知，超聲溫度的升高造成黃酮類化合物提取率呈現出急速上升后緩慢下降的現象，超聲溫度50℃時所對應的黃酮提取率最高（4.5%）。高于50℃后提取率下降，推測可能是因為超聲溫度可以將枸杞葉細胞破碎增強空化作用，加速化學成分的溶出；當超聲溫度高于一定程度后，由于高溫導致空化作用減弱阻礙了黃酮化學成分的溶出[14]。因此，選擇超聲溫度50℃進入后續試驗。

2.2.2 料液比對新鮮枸杞葉黃酮提取率的影響料液比對化學成分的溶出具有重要作用，由圖4可知，新鮮枸杞葉中黃酮提取率隨著料液比的增大表現為先上升后逐漸下降趨勢，在料液比為1∶25時，黃酮提取率達到最高（3.7%），而此料液比后提取率下降的原因可能是由于原材料用量固定的情況下溶劑用量倍增造成新鮮枸杞葉中黃酮類化合物溶出率達到飽和，而其易溶于乙醇化學成分的逐步溶出影響了黃酮的分離[15]。因此，選擇料液比1∶25進入后續試驗。

2.2.3 乙醇體積分數對新鮮枸杞葉黃酮提取率的影響 由圖5可知，不同體積分數的乙醇對醇溶性物質的溶出影響程度不同。新鮮枸杞葉黃酮提取率隨著乙醇體積分數的升高表現出先上升后下降的趨勢，并于體積分數65%乙醇下達到最高（3.8%），此后提取率均低于此值。預測造成黃酮提取率下降的原因是乙醇體積分數過高導致更多脂溶性物質析出從而降低了目標物的溶出率[16-17]。因此，選用65%乙醇進入后續試驗。

2.2.4 超聲功率對新鮮枸杞葉黃酮提取率的影響 從圖6可以看出，超聲功率對黃酮類化合物提取率的影響程度較小，功率小于300 W時黃酮提取率趨于平穩；當功率達到300～400 W時黃酮類化合物提取率有效升高最終達到臨界值（3.3%）；超聲功率大于400 W后新鮮枸杞葉黃酮提取率驟然下降，其原因可能是由于功率在100～300 W時枸杞葉細胞內黃酮受熱效應影響而加速溶解，當功率高于400 W時，溫度隨之升高造成乙醇部分揮發影響了總黃酮的溶出[18]。因此，選用超聲功率400 W進入后續試驗。

2.3 提取工藝的優化

2.3.1 響應曲面分析及優化 超聲溫度（A）、超聲功率（B）、乙醇體積分數（C）、料液比（D）對黃酮提取率（Y）影響的具體數據進行多元二次回歸，得到回歸模型方程：Y=5.59+0.35A－0.47B+0.68C+0.098D－0.41AB+0.48AC－0.16AD－0.67BC－1.21BD－0.73CD+0.13A2－0.33B2+0.051C2+0.17D2。

根據表2中P值大小得出，對黃酮提取率的影響因素由大到小依次為C＞B＞A＞D。模型中交互項AB、AC、BC、BD、CD對黃酮提取率均產生顯著影響（P＜0.05），且交互項BC、BD、CD達到極顯著水平（P＜0.01），其中，失擬誤差P值為0.981 0＞0.05，表明多元二次回歸模擬方程可以充分說明各因素與提取率之間的函數關系，模型不必再選擇更高級別函數。相關系數R2=0.964 8與R2Adj=0.929 7趨近于100%，代表方程模型與試驗所得數據契合度較高。模型的P＜0.001，證實模型與試驗所得數據擬合效果絕佳，可以用于新鮮枸杞葉中黃酮提取率的理論預測。

表2 模型的方差分析Tab.2 Variance analysis of the model

響應曲面設計建立的曲面模型可以對影響黃酮提取率的單因素以及兩因素之間的交互作用作出評價，從而確立最佳水平范圍。3D響應曲面圖中不同的傾斜度、顏色及整體趨勢可以反映出兩坐標軸對應的因素之間對響應值即黃酮提取率的影響程度[19]。由圖7可知，BC、BD、CD交互作用曲面傾斜度相比其他較高，且曲面顏色可以直觀看到呈現加深趨勢，而AD交互作用曲面傾斜度一般、顏色無明顯變化，說明BC、BD、CD兩者之間交互作用較顯著，表現為響應值變化趨勢劇烈增加。圖7所示的各響應面形態各異且頂點都在試驗水平范圍內，說明黃酮提取率最佳優化條件在試驗的水平范圍內。

2.3.2 驗證試驗 考慮到實際操作的可行性，數據分析所得最佳提取工藝（超聲溫度58.18℃、超聲功率320.69 W、料液比1∶28.96、乙醇體積分數67.22%）經調整后修正為60℃、超聲功率300 W、料液比1∶30、乙醇體積分數65%，經過試驗驗證后得到新鮮枸杞葉中黃酮實際提取率為7.742 1%，與理論值（7.706 1%）相差0.036百分點，因此，試驗結果表明響應曲面設計所得模型的擬合度較高、產生的誤差較小，用模型確定的方程式預測新鮮枸杞葉中黃酮提取率的方法可信度很高。

2.4 黃酮提取液的抗氧化性

2.4.1 新鮮枸杞葉黃酮提取液對DPPH自由基的清除能力 DPPH[20-21]作為具有單一電子、穩定的自由基，在有機溶劑中呈現特殊的紫色反應，而抗氧化劑的出現會導致產生的紫色變淺，從而發生由于強抗氧化性而造成吸光度值減小的現象。從圖8可以看出，黃酮提取液質量濃度升高，造成清除率逐漸增大，當質量濃度在3～5 mg/mL時清除率趨于平穩，在5 mg/mL時清除率達86.48%，可以看出，此樣液對DPPH自由基具有一定的消除作用，且最終受濃度的影響會變小。

2.4.2 新鮮枸杞葉黃酮提取液對·OH自由基的清除能力 Fe2+、H2O2與水楊酸發生反應所得產物·OH自由基于510 nm波長下有特殊吸收，當樣品中存在可與·OH自由基反應的物質時，由于有色化合物產率減少，從而造成吸光度值降低，并可得出樣品抗氧化活性增強的結論[22]。從圖9可以看出，清除率隨著樣液質量濃度的升高而逐漸增大，在5 mg/mL時清除率達80.36%，以上結果顯示，不同質量濃度的新鮮枸杞葉提取液對·OH自由基有近似呈正相關線性關系的消除作用。

2.4.3 新鮮枸杞葉黃酮提取液對ABTS自由基的清除能力 供試品對ABTS自由基有清除活性的基本思路為：K2S2O8與ABTS反應生成穩定的ABTS+，供試品由于含抗氧化物質可與ABTS+反應得到最終產物，因此，使原溶液褪色造成吸光度值降低[23]。由圖10可知，隨著新鮮枸杞葉的提取液質量濃度逐步升高，對ABTS自由基的清除能力呈現平穩-輕微下降-迅速上升的趨勢。出現輕微下降的原因可能是供試品質量濃度太低導致吸光度數據差距較小，此差距低于儀器檢測下限，造成儀器檢測是近似認為無顯著差異。當達到一定質量濃度后，由于質量濃度差距增大導致吸光度上升。結果顯示，黃酮提取液質量濃度在5 mg/mL時清除率可達67.06%，證實該提取液對ABTS自由基有消除效果且與質量濃度高低呈正相關，因此，新鮮枸杞葉黃酮提取液在一定程度上具有抗氧化能力。

3 結論與討論

超聲波可以產生高速、強烈的空化效應和攪拌作用，結合提取溶劑的滲透作用可以達到破壞中藥材植物的細胞壁、有效加大溶劑與目標物的接觸面積的效果，從而縮短化學成分的溶出時間，提高有效成分的提取率。超聲波提取法已經廣泛應用于各中藥材活性成分的提取方式，為活性成分的溶出提供了有利的后天條件。張鷹等[24]采用超聲波提取法得到枸杞葉中黃酮提取率為5.62%，小于本試驗新鮮枸杞葉黃酮提取率（7.742 1%），造成此現象的原因可能是本試驗采用了超聲波輔助酶解方法。

隨著酶解法在提取手段上突顯出的優勢，酶解提取、超聲波輔助酶解提取法等新型提取方式隨之產生，且極大提高了化學成分的提取率、增強了道地藥材的生物利用度。然而由于不同酶的作用不同，產生的效果也不盡相同。陳書明[25]研究發現，不同水解酶對杜仲葉總黃酮的提取率影響效果依次為蛋白酶＞單寧酶＞纖維素酶＞果膠酶。而戢得蓉等[26]等對比不同水解酶對雪蓮果葉總黃酮提取率的影響，得出各種水解酶的提取率依次為纖維素酶＞果膠酶＞蛋白酶。因此，可以看出纖維素酶的利用度最好。本試驗選用纖維素酶進行酶解的原因除利用度較好外，還考慮到纖維素酶的特性。纖維素酶是專門用于降解纖維素的一種非單體的復合酶，是具有共同作用的多樣化酶系，其中富含的酶活力越高產生的酶解產物越徹底[27-28]。本研究前期對比了多家公司生產的纖維素酶，最終選定酶活力相對較好的鄭州宇控生物科技有限公司生產的纖維素酶。基于此上優點，本研究選用纖維素酶破壞植物細胞壁，利用超聲波輔助酶解的優勢使細胞內的活性成分和營養物質可以大幅度溶出，從而達到本試驗目的。

本試驗結果表明，超聲波輔助酶解法提取新鮮枸杞葉黃酮的手段是切實可行的，經響應曲面法分析優化后得到新鮮枸杞葉黃酮的最佳提取條件為：超聲溫度60℃、超聲功率300 W、料液比1∶30、乙醇體積分數65%，在此條件下，黃酮實際提取率為7.742 1%。此外，由抗氧化活性數據可以得出，最佳工藝條件制備所得的不同新鮮枸杞葉黃酮提取液質量濃度對各項自由基有不同的清除效果。當提取液質量濃度為5 mg/mL時，DPPH、·OH和ABTS自由基對應的清除率分別為86.48%、80.36%、67.06%。總之，采用超聲輔助酶解提取得到新鮮枸杞葉中黃酮提取率較高，對進一步研究其功效具有深遠意義。