番茄青枯病拮抗菌株的篩選、鑒定及發酵條件的優化

盧曉虹，許 敏，李甜爽，劉海霞，王美琴

（山西農業大學 植物保護學院，山西 太谷 030801）

近年來，隨著設施番茄種植面積的不斷擴大，品 種單一，連作現象嚴重等問題導致土傳性病害發生嚴重，其中由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）侵染引起的番茄青枯病，嚴重時造成毀滅性危害。番茄青枯病是設施栽培的重要病害之一，該病可造成番茄植株大面積萎蔫直至死亡，發病較嚴重的田塊發病率可高達80%以上，嚴重影響番茄的產量，使其產量急劇下降甚至絕收[1-3]。對于番茄青枯病常用的防治方法主要有施用化學藥劑、改良土壤結構和性質以及選育抗病品種等，但這些防治方法效果均不穩定[[4-5]，且長期使用化學藥劑會導致土壤板結、農藥殘留、產生抗藥性、微生物態體系遭到破壞等不良影響，因此，生物防治成為解決土傳性病害最有效、安全的防治方法之一[6-7]，同時也受到人們的廣泛關注與研究。利用拮抗菌防治番茄青枯病成為具有應用前景的防治措施之一，如何分離篩選出在室內有較好抑菌效果的菌株并可在田間發揮理想的防治效果，是生物防治面臨解決的關鍵性問題。王麗麗等[4]利用篩選到的拮抗菌株W12和W118進行田間生防效果試驗，其防治效果達到43.0%。鄭雪芳等[1]采用抑菌圈法篩選出24個對青枯雷爾氏菌具有拮抗作用的菌株，其中，菌株FJAT-20261和FJAT-19700盆栽防效分別達72.73%和67.77%。羅坤等[8]篩選出6株對番茄青枯病有拮抗活性的菌株，其中，1株拮抗菌株室內盆栽防效達96.40%。進一步加強此方面的研究將有效控制青枯病的發生和流行，從而確保拮抗菌株持續穩定的發揮防治效果，特別是具有拮抗效果微生物的生存環境和生態適應能力是決定防治效果的關鍵所在。利用生防菌防治植物病害，主要是通過其代謝產物及其產生的抗菌活性物質對病菌起到抑制作用[9-10]。微生物在代謝過程中，會受到諸多因素影響，如培養時間、p H、溫度、培養基組分等[11]。有益微生物在適宜的環境條件下培養有利于其生長，通過對發酵條件的優化增加拮抗菌株抑菌活性物質的數量，從而提高抑菌效果[12]。發酵優化過程中常采用單因素試驗與正交試驗相結合的方法[13]，以測量的吸光度值及抑菌圈大小為參考指標[14-16]，對發酵培養基配方及發酵條件進行優化[17-19]。

目前，番茄青枯病生物防治方法大都處于試驗階段，進入實際生產的很少。前人篩選出來的拮抗菌株在室內的盆栽試驗當中效果明顯，但在田間條件下出現防治效果不太穩定的現象。為了能有效控制番茄青枯病害的發生流行，分離篩選出具有較好抑菌效果的菌株具有重要意義。目前，番茄青枯病生物防治方面缺乏高效穩定的生防菌株。為此，本試驗從健康番茄植株根際土壤中篩選出理想的拮抗菌株，并對其生長條件進行優化，旨在為進一步開發出有效防治青枯病的生物菌劑提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試土樣 土樣采集于太谷縣范村鎮象谷村健康番茄植株的根際土壤，共采集38份土樣。

1.1.2 供試菌株 番茄青枯病菌（Ralstonia solanacearum），由山西農業大學植物保護學院植物病理實驗室保存提供。

1.1.3 供試培養基 NA培養基：蔗糖10 g，蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，瓊脂粉15 g，1 000 mL蒸餾水，p H值7.0；NA培養基中不加瓊脂粉即NB培養基。

1.2 試驗方法

1.2.1 番茄根際土樣中微生物的分離 采用稀釋涂布分離法，每份土樣取10 g，碾碎后加入三角瓶（有玻璃珠）中，再加入90 mL無菌水振蕩30 min，靜止后依次稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6g/mL質量濃度梯度的菌懸液，每個梯度取0.1 mL涂布在NA平板上[20]，然后置于30℃的培養箱中，培養24 h后觀察，挑取不同形態特征的單菌落純化后進行編號。

1.2.2 番茄青枯病菌拮抗菌株的篩選 初選：采用對峙培養法，將培養48 h的番茄青枯病菌菌懸液稀釋1 000倍后涂布在NA平板上，靜止10 min后，將1.2.1分離純化的147個菌株均勻點接在平板上[20]，每個平板點接4個菌株，在30℃培養24 h后觀察，記錄有抑菌效果的菌株，每個處理重復3次。

復選：將初選具有拮抗效果的細菌菌株18個分別接種到NB培養液中，置于28℃培養箱中培養48 h制成菌懸液，稀釋1 000倍后取0.1 mL均勻涂布在NA平板上，靜止20 min后將蘸有番茄青枯病菌發酵液的無菌濾紙小圓片接在平板中央，置于28℃培養箱中培養，觀察并記錄抑菌圈的大小，每個處理重復3次。

1.2.3 拮抗菌株B-6的鑒定

1.2.3.1 形態鑒定 將1.2.2篩選到的拮抗菌株B-6接種到NA平板上，觀察細菌菌落的大小、顏色、邊緣形狀、隆起形狀和透明度及觀察在NB液體培養液菌株的培養性狀，如有無色素的產生、有無沉淀、有無菌璞和菌膜的產生、有無特殊氣味等；通過革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體的形態，通過掃描電鏡在電鏡下觀察菌體的形態、大小等特征。

1.2.3.2 生理生化鑒定 測定生理生化指標的具體試驗方法參照文獻[21-22]進行。

1.2.3.3 分子生物學鑒定 采用TSINGKE植物DNA提取試劑盒對拮抗菌株B-6的基因組DNA進行提取，且對拮抗菌株B-6的16S rDNA進行PCR擴增反應。16S rDNA PCR擴增反應引物：正向引物為5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，反向引物為5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；提取的DNA樣品適量稀釋后作為PCR模板，以1×TSE101金牌mix進行擴增；反應程序為：98℃預變性2 min；98℃變性10 s，56℃退火10 s，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸5 min。PCR反應完成后，將擴增好的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并將準備好的PCR擴增產物送至西安擎科測序有限公司進行測序。

1.2.4 拮抗菌株B-6生長曲線的測定及種子培養 將1.2.2篩選出的拮抗菌株B-6菌株活化后，從平板上挑取2環接種于50 mL（250 mL錐形瓶）NB培養基中，于28℃、180 r/min振蕩培養，每隔1 h取出1瓶測其吸光度（OD600），重復3次。以OD600為縱坐標、培養時間為橫坐標，繪制拮抗菌株B-6的生長曲線[23]。根據生長曲線培養菌種直到生長到對數期后將其接種于發酵培養基中進行后續的試驗。

1.2.5 拮抗菌株B-6發酵培養基的優化

1.2.5.1 最佳碳源的篩選 蛋白胨5 g、氯化鈉3 g、蒸餾水1 000 mL、p H值調至7.0左右，分裝于250 mL的錐形瓶中，每瓶裝液量50 mL，制成無碳源基礎培養液。將葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉及果糖共5種碳源配制成體積分數為10%的溶液[24]，與無碳源基礎培養液分開滅菌。滅菌完畢后，將碳源溶液以1%的量添加到基礎培養液中。待冷卻后加入1%的拮抗菌株種子液，置于28℃、180 r/min搖床中培養24 h，將發酵液取0.1 mL涂布在NA平板上，平板中央點接番茄青枯病菌進行平板對峙，根據其抑菌圈大小來確定最佳碳源。

1.2.5.2 最佳氮源的篩選 蔗糖10 g、氯化鈉3 g、蒸餾水1 000 mL、p H值調至7.0左右，分裝于250 mL的錐形瓶中，每瓶裝液量50 mL，制成無氮源基礎培養液。將蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、氯化銨及硫酸銨共5種氮源配制成體積分數為5%的溶液[24]，與無氮源基礎發酵培養液分開滅菌。滅菌完畢后，將氮源溶液以0.5%的量添加到基礎培養液中。方法同1.2.5.1，根據其抑菌圈大小選出最佳氮源。

1.2.5.3 最佳無機鹽的篩選 蔗糖10 g、蛋白胨5 g、蒸餾水1 000 mL，p H值調至7.0左右，分裝于250 mL的錐形瓶中，每瓶裝液量50 mL，制成不含無機鹽的基礎培養液。將氯化鈉、磷酸氫二鉀、氯化鈣、硫酸亞鐵及氯化鉀共5種無機鹽配制成體積分數為3%的溶液[24]，與不含無機鹽的基礎培養液分開滅菌。滅菌完畢后，將無機鹽溶液以0.3%的量添加到基礎培養液中。方法同1.2.5.1，根據其抑菌圈大小選出最佳無機鹽。

1.2.5.4 正交試驗 發酵培養基各因素間最佳配比組合：以抑菌圈直徑的大小為衡量指標，對發酵培養基中的碳源體積分數（A）、氮源體積分數（B）、無機鹽體積分數（C）進行優化。每個影響因素設置3個水平，組成3因素3水平正交試驗。各因素水平如表1所示，之后按SPSS正交試驗設計出的各因素水平的組合方案進行試驗，每個處理重復3次。將NB培養基分裝50 mL于規格為250 mL錐形瓶中，接種1%的菌株種子液，后置于28℃、180 r/min的恒溫搖床中培養24 h，通過對峙試驗測量其抑菌圈直徑大小。對測量結果進行極差分析和方差分析，確定各因素各水平間的最佳組合。

表1 發酵培養基因素水平Tab.1 Fermentation medium factor level %

1.2.6 拮抗菌株B-6發酵條件的優化 以確定的最佳發酵培養基為基礎，選出對發酵效果影響較大的發酵時間（D）、裝液量（E）、接種量（F）及pH（G）4個因素進行優化試驗。每個因素設置3個水平，組成4因素3水平試驗（表2），使用SPSS進行正交試驗設計，確定組合方式進行試驗。各處理分別置于相應的培養條件下進行發酵培養，24 h后與番茄青枯病原菌進行平板對峙測量其抑菌圈直徑大小，3次重復。對測量結果進行極差分析和方差分析，經綜合分析確定最佳發酵條件。

表2 發酵條件因素水平Tab.2 Fermentation condition factor level

1.3 數據處理

試驗采用Excel 2019進行圖表的制作；采用SPSS 21.0進行數據處理、極差分析及顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 番茄青枯病菌拮抗菌株分離與篩選

從38份土樣中共分離篩選出147株平板菌落形態特征不同的菌株，初篩結果分離篩選出18株有抑菌效果的拮抗菌株，經純化和復篩，其中，拮抗菌株B-6與B-17菌株抑菌效果最好，且比較穩定，B-6抑菌圈直徑達到13.8 mm，B-17抑菌圈直徑達到12.3 mm，其拮抗菌株的平板抑菌效果如圖1所示。

2.2 拮抗菌株B-6培養性狀及菌體形態

從圖2可以看出，拮抗菌株B-6在平板上的單菌落為不規則圓形，呈淡黃色，不透明，微隆起，略有光澤度，邊緣不整齊，有刺激性氣味產生；拮抗菌株B-6在培養液中培養，逐漸變渾濁，3 d后，試管內出現乳白色沉淀，5 d后在液體表面長出了白色菌璞，在培養液中出現片狀菌膜（圖3）。

拮抗菌株B-6經革蘭氏染色鏡檢可知G+，菌體短桿狀，無莢膜，無鞭毛（圖4）；通過電鏡觀察可知，拮抗菌株B-6細胞為短桿狀，菌體大小約為（1.5～2.7）μm×（0.5～1.2）μm，不具有鞭毛，單個或2～4個細胞形成短鏈（圖5）。

2.3 拮抗菌株B-6的生理生化特性

對拮抗菌株B-6各項生理生化指標進行鑒定，結果表明（表3），該菌株在20～37℃可以生長，4℃以下和41℃以上停止生長；耐鹽性與需鹽性試驗表明，該菌株可以在含有2%～7%的NaCl培養液中生長；熒光色素中菌株培養1、3、5 d后在紫外燈下觀察均有熒光；丙二酸與檸檬酸鹽試驗中呈陽性。葡萄糖氧化發酵中經觀察發現，2種指示培養基均產酸變黃，為發酵型；接觸酶和甲基紅試驗呈陽性；糖類發酵試驗指示劑沒有變色呈陰性；淀粉水解反應呈陽性；V-P測定試驗呈陰性；硝酸鹽還原測定試驗為硝酸鹽還原陽性。

表3 拮抗菌株B-6的生理生化鑒定結果Tab.3 Physiological and biochemical identification result of the strain B-6

2.4 拮抗菌株B-6的分子生物學鑒定

通過提取拮抗菌株B-6的基因組DNA并進行PCR擴增，得到1條長約1 500 bp的DNA片段，經擴增產物測序后得到長度為1 424 bp的16S rDNA序列，將上述16S rDNA與NCBI數據庫中已注冊的16S rDNA序列進行同源相似性比較，同時構建系統發育樹（圖6）。對比結果表明，拮抗菌株B-6與假單胞菌的遺傳距離最近，且它與銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）處于同一分支上，拮抗菌株B-6 16S序列比對結果為Pseudomonasaeruginosastrain Pa84（或同屬）。綜合拮抗菌株B-6的形態特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析，將該菌株鑒定為銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）。

2.5 拮抗菌株B-6的生長曲線繪制

由圖7可知，拮抗菌株B-6生長曲線分布：0～7 h為延遲期，8～22 h為對數生長期，23～25 h為穩定期，25 h后細菌生長進入衰亡期。在菌株的對數生長期內，菌株生長迅速，代謝旺盛，適合作種子液。因此，最終確定拮抗菌株B-6發酵用種子液培養時間為22 h。

2.6 拮抗菌株B-6發酵培養基配方的優化

通過比較不同培養基發酵所得到的發酵培養液的抑菌效果發現，當發酵培養基的碳源為麥芽糖時，抑菌效果最佳，抑菌圈直徑可達到（15.80±0.30）mm。通過比較加入不同氮源發酵得到的發酵培養液的抑菌效果發現，當發酵培養基氮源為蛋白胨時，抑菌效果最佳，抑菌圈直徑可達到（16.20±0.20）mm。通過試驗添加5種不同的無機鹽所得到的發酵培養液測定的抑菌效果發現，當發酵培養基無機鹽為氯化鈉時，抑菌效果最佳，抑菌圈直徑可達到（13.40±0.25）mm（表4）。

表4 拮抗菌株B-6發酵培養基配方的優化Tab.4 Optimization of fermentation medium formulation of antagonistic strain B-6 mm

2.7 正交試驗結果

2.7.1 拮抗菌株B-6發酵培養基配方正交優化結果 在確定拮抗菌株B-6合適的發酵培養液各組分種類的基礎上，進行正交優化試驗。從表5可以看出，3個因素的極差（R）值存在差異，各因素對拮抗菌株B-6生長量的影響大小通過R值反映，R值越大則表明該因素對菌株的影響效果越大，反之則越小。

表5 拮抗菌株B-6發酵培養基最佳組合的正交試驗結果及極差分析Tab.5 Orthogonal test results and range analysis of the optimal combination of fermentation medium of antagonistic strain B-6

由表5可知，RC＞RA＞RB，即無機鹽＞碳源＞氮源，無機鹽對菌株的拮抗活性抑菌效果影響最大，其次依次為碳源和氮源，A 3B2C2組合所產生的抑菌圈直徑為16.5 mm，與采用基礎發酵培養基培養所得發酵液對峙產生的抑菌圈直徑13.8 mm相比，發酵優化后抑菌圈直徑增加了19.6%，差異較明顯。方差分析和顯著性檢驗如表6所示，碳源、氮源及無機鹽的P值均大于0.05，表明3種因素差異均不顯著，但從表5可以看出，這3種發酵配方因素變化對拮抗菌株B-6拮抗活性物質的生物量影響差異從大到小依次為無機鹽＞碳源＞氮源，即無機鹽變化對其影響較大，氮源變化對其影響較小。經綜合極差分析和方差分析結果，最終確定拮抗菌株B-6最佳發酵培養基組合為A 3B2C2，即麥芽糖3%（30 g）、蛋白胨1.0%（10 g）、氯化鈉1.0%（10 g），蒸餾水1 000 mL。

表6 拮抗菌株B-6發酵培養基最佳組合的方差分析Tab.6 Analysis of variance of the optimal combination of fermentation medium of antagonistic str ain B-6

2.7.2 拮抗菌株B-6發酵條件正交優化結果 拮抗菌株B-6最佳發酵條件正交試驗及結果分析如表7所示，4個因素極差有差異，對于拮抗菌株B-6產生拮抗物質生物量大小的影響通過R值大小反映，R值越大，則表明該因素對菌株的影響效果越大，反之則越小。由表7可知，RD＞RG＞RE＞RF，即發酵條件對拮抗菌株B-6拮抗活性的影響依次為發酵時間＞pH＞裝液量＞接種量，說明發酵時間對拮抗菌株B-6的拮抗活性物質的生物量影響最大，其次依次為p H、裝液量及接種量。通過方差分析和顯著性檢驗發現（表8），發酵時間、裝液量、接種量及p H的P值均大于0.05，表明4種因素差異均不顯著。但從表7可以看出，影響拮抗菌株B-6產生抗菌活性物質數量的4種發酵條件因素其差異大小依次為pH＞裝液量＞發酵時間＞接種量，即pH值變化對其影響較大，接種量變化對其影響較小。經綜合極差分析和方差分析結果，最終確定拮抗菌株B-6的最佳發酵條件組合為D1E3F1G3，即發酵時間24 h、裝液量100 mL（規格為250 mL錐形瓶）、接種量1.0%（1 mL），p H值8。

表7 拮抗菌株B-6發酵條件的正交試驗結果及極差分析Tab.7 Orthogonal test results and range analysis of fermentation conditions of antagonistic strain B-6

表8 拮抗菌株B-6發酵條件正交試驗結果方差分析Tab.8 Variance analysis of orthogonal test results of fermentation conditions of antagonistic strain B-6

續表7 拮抗菌株B-6發酵條件的正交試驗結果及極差分析Tab.7（Continued） Orthogonal test results and range analysis of fermentation conditions of antagonistic strain B-6

3 結論與討論

生物防治是控制番茄青枯病有效的途徑，主要是利用分離篩選到的拮抗菌株對其進行防控。目前，國內許多學者從植株根際土壤中分離篩選具有拮抗作用的生防細菌。畢凱麗等[25]從土壤中篩選對水稻胡麻斑病病原菌（Helminthospotium oryzaeBreda de Hann）具有穩定拮抗作用的細菌。王麗麗等[6]從番茄青枯病重病田塊的健康植株根際土壤中分離篩選得到2株高效拮抗菌株，經16S rDNA鑒定均為芽胞桿菌屬。鄭雪芳等[1]采用抑菌圈法從不同地理來源的植物根際土壤中篩選出24個對青枯雷爾氏菌具有拮抗作用的芽孢桿菌。

本研究利用稀釋涂布分離篩選到1株對番茄青枯病菌（Ralstonia solanacearum）抑菌效果最好的拮抗菌株B-6，經過鑒定確定為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），并對其發酵液配方及發酵條件進行了優化，使其發酵液抑菌效果最強。結果表明，健康植株的根際土壤中含有拮抗菌株，可以用來防治植物病原菌，有望成為生物防治病害又一主力軍。但篩選出的拮抗菌株如何在大田土壤中能有效定殖且發揮高效穩定的防治效果，有待進一步研究。

利用拮抗菌株進行生物防治過程中，如何使其產生較多抗菌物質及提高抑菌效果對防治植物病害十分重要。拮抗菌株發酵液除了受到發酵培養基各組分影響外，還會受到培養條件的制約，通過對發酵液配方及發酵條件的優化，拮抗菌株抑菌物質數量顯著提高，從而充分發揮其抑菌作用[26-27]。目前對生防菌發酵條件優化的研究，一般采用單因素結合正交試驗的方法[28]。正交試驗設計是研究多因素多水平的一種設計方法，具有高效和快速的特點。菌體發酵是一個較復雜過程，受到很多因素的影響。本試驗根據單因素試驗的結果進行正交設計優化，優化了發酵培養基各組分及最佳發酵條件，拮抗菌株B-6最佳發酵培養基為麥芽糖3%（30 g）、蛋白胨1.0%（10 g）、氯化鈉1.0%（10 g），蒸餾水1 000 mL，最佳發酵條件為發酵時間24 h、裝液量100 mL（規格為250 mL錐形瓶）、接種量1.0%（1 mL），p H值為8。拮抗菌株發酵條件優化以對峙抑菌圈大小作為衡量指標，前人已有許多的報道[29-32]。楊曉楠等[13]采用正交試驗設計確定了黃瓜菌核病拮抗菌株T 111的最佳發酵培養基組合和發酵條件，優化后其抑菌效果增加了69.4%；劉曉琳等[17]通過采用單因素試驗與正交試驗方法篩選出對棗果黑斑病有抑菌效果的拮抗菌xj063-1菌株的最佳發酵培養基配方和發酵條件；侯敏等[29]在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗研究了培養基各組分對拮抗細菌S13產生芽孢的影響。

本研究僅是在恒溫搖床條件下對拮抗菌株B-6發酵培養基配方及發酵條件進行優化，為今后拮抗菌株B-6生物菌劑的研發和研究進展提供了一定的理論依據，但沒有將其投入到盆栽及大田防效試驗中檢測其防治效果。由于發酵是一個較復雜的過程，試驗中仍存在許多不足之處，需進一步的調整與完善，為了使其能夠產業化，還需進一步對其代謝過程進行研究。目前，該菌株已保存在中國微生物菌種保藏中心，編號為CGMCC No.24048，正在申報國家發明專利，已被國家專利局受理。