非小細胞肺癌中m6ARNA甲基化的研究進展

張志文 李也鵬

【關鍵詞】 N6-甲基腺嘌呤;表觀遺傳修飾;非小細胞肺癌

中圖分類號：R734.2?? 文獻標志碼：A?? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2022.04.012

全球腫瘤流行病學調查中，占據全球發病率和病死率最高的惡性腫瘤是肺癌，現如今在我國男性惡性腫瘤發病率最高的是肺癌，在女性中肺癌已經是除乳腺癌外發病率最高的腫瘤[1]，且在多中心研究中發現肺癌確診時分期越晚，則臨床表現越多。不同TNM分期的非小細胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）生存率差別明顯，分期越晚則生存率越低[2]。既往關于表觀遺傳學與非小細胞肺癌的研究發現二者關系密切，表觀遺傳修飾往往通過DNA/RNA甲基化、組蛋白修飾及染色體三維構象的改變來干擾正常基因的表達和功能[3～4]，以影響腫瘤的發生發展及耐藥。其中N6-腺苷酸甲基化（N6-methyladenosine，m6A）是最常見的一類RNA修飾，并且在組織發育、干細胞自我更新和分化、腫瘤耐藥等過程中發揮了重要作用[5]。因此肺癌的早期篩查能夠有效地提高肺癌患者的生存率，則與m6A相關的研究具有重要意義，其不僅關系著肺癌的早期診斷，甚至可能開啟微創無創診斷，也關系著新的靶向藥物的研究，為肺癌用藥做出貢獻[6]。

1 m6A RNA甲基化

過去對于表觀遺傳學的研究多集中于DNA修飾及組蛋白修飾，然而2012年的一項研究發現位于腺嘌呤的甲基化修飾，為后續表觀遺傳修飾的研究揭開了新的篇章[7]。目前，在表觀遺傳修飾中RNA甲基化的探索進行得如火如荼，其中作為最多見的一種RNA轉錄后修飾，m6A RNA甲基化是真核生物mRNAs中最為豐富的修飾，其主要集中于mRNA的啟動子區，終止密碼子附近以及RRACHmotif內，并受“寫入”“擦除”“讀取”蛋白的調控，以此影響RNA的穩定性、mRNA的翻譯、選項性剪接及聚腺苷酸化[8]。其中“寫入”蛋白-甲基化轉移酶主要以復合物形式發揮生物學作用以催化腺苷酸發生m6A RNA甲基化修飾;反之“擦除”蛋白-去甲基化酶對發生甲基化修飾的堿基行去甲基化;而“讀取”蛋白-甲基化閱讀蛋白可辨別出現甲基化的堿基，進而調控下游通路，m6A RNA甲基化的修飾過程動態可逆[6，9]。

2 m6A甲基化相關蛋白

m6A甲基化過程主要受到三種蛋白的調控：甲基轉移酶（writer）、去甲基化酶（eraser）及甲基結合蛋白（又稱識別蛋白，reader）。m6A writer是一類可促進m6A甲基化形成的酶，其中最早發現的m6A writer甲基轉移酶3（methyltransferase-like3，METTL3）具有促進m6A形成的作用，但只能在mRNA內不能使rRNA甲基化;而甲基轉移酶4（methyltransferase-like4，METTL4）與METTL3為同系蛋白，同樣具有促進m6A修飾形成的作用;另外作為m6A writer復合物的有效成分，甲基轉移酶14（methyltransferase-like14，METTL14）可與METTL3反應雜合，并且其也是RNA連接蛋白，可提高m6A writer的活性[4]。

目前可知的m6A eraser有脂肪和肥胖相關蛋白（fat-mass and obesity-associated protein，FTO）、Alk B同源蛋白 5（AlkB homolog 5，ALKBH5）以及一些適配因子，如WT1 蛋白相關蛋白（Wilms tumor 1-associated protein，WTAP）、RNA 結合基序蛋白 15（RNA-binding motif protein 15，RBM15）、YTH結構域（YTH domain，YTHs）和核不均一核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoproteins，HNRNPs）等[3，8]。這些m6A eraser通過多種方式結合RNA上的m6A來影響不同腫瘤的發生發展。其中，FTO是首個被發現的m6A去甲基轉移酶，定位于核散斑，主要調節3′非翻譯區的m6A，研究發現其在細胞內被敲低時，mRNA的m6A水平升高，相反當FTO過表達時，mRNA的m6A水平受到抑制[10]。FTO的探索中證實了m6A甲基化是一種動態可逆的過程，其不僅與肥胖相關，其誘導的慢性炎癥還參與多種腫瘤的發生發展及預后[11～12]。AlkB亞家族中的ALKBH5的去甲基化活性具有卓越效率，并可調控mRNA的各種生物學過程，從而達到調控細胞存活、凋亡等多種生理功能。在核散斑體中ALKBH5的沉默會損害其mRNA的加工與輸出[13～15]。

m6A reader可介導m6A的生理行為并調控RNA功能，其常見蛋白有真核起始因子3C（eukaryotic translation initiation factor 3，eIF3）和YTH蛋白家族蛋白。目前研究較多的為YTH蛋白家族蛋白包括兩種類型YTHDFs和YTHDCs。YTHDFs又分為3種亞型YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3;YTHDCs也分為2種亞型YTHDC1和YTHDC2[6]。當同一個轉錄樣本未發生RNA甲基化時，YTH家族蛋白可與m6A優先結合。第一個被發現以m6A依賴的方式介導RNA衰變的m6A reader為YTHDF2[16]。作為核m6A讀取器的YTHDC1，結合m6A在377及428位的色氨酸殘基上。YTHDC2最早發現于HCV病毒基因組復制中并在人類細胞中表達較高，其通過缺氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）和twist家族BHLH轉錄因子1（twist family of basic helix-loop-helix transcription factor 1，TWIST）的翻譯促進腫瘤侵襲轉移[17～18]。另外，新型m6A閱讀器胰島素樣生長因子2（IGF2）可識別GG（m6A）C序列靶向轉錄mRNA，彭偉等人[19]于2020年發現在NSCLC細胞中，在胞質及胞膜中發現IGF2BP1大量表達，且在組織水平肺癌組織與癌旁組織比較IGF2BP1表達增加。

3 m6A與非小細胞肺癌

據報道，多種癌癥中發現m6A甲基化修飾表達均升高或降低，在癌癥中其作用也在逐漸被探索發現。當前，在多種腫瘤的生長侵襲過程中m6A甲基化的研究是腫瘤生物學研究的熱點之一。尤其在NSCLC的生長與侵襲過程中，m6A甲基化起著關鍵作用。m6A相關蛋白表達的異常與NSCLC惡性增殖、遷移、侵襲、轉移和耐藥等相關。因此，研究m6A修飾在NSCLC中的生物學功能，明確臨床活檢標本m6A調控蛋白的異常表達，鑒別m6A修飾的關鍵因子改變，對分析及了解NSCLC發病機制具有重要意義，可以為NSCLC的診斷治療及預后評估提供理論依據[20]。后續研究中發現m6A調控因子可通過調控轉錄組靶蛋白或關鍵信號通路發揮其病理作用。

3.1 m6A writer與非小細胞肺癌

1997年，METTL3第一次在Hela細胞中提取被發現作為m6A“writers”發揮作用，其不僅可以促進m6A的合成，有兩個SAM結合位點可與SAM結合，還作為甲基轉移酶的重要亞基。因為METTL3在胞質和胞核均表達，所以m6A修飾可以發生在這兩個部位。美國哈佛醫學院的Richard I Gregory教授和其研究團隊發現，在NSCLC細胞中METTL3可促進促癌基因翻譯，通過在胞質中的METTL3與翻譯起始元件ELF3b結合，提高多聚核糖體的合成，促使促癌基因過表達翻譯，進而促進了NSCLC細胞的生長、增殖和侵襲[21]。2017年，魏文平等[22]在2012～2016年收集50例非小細胞肺癌標本，發現較高表達水平的METTL3生存率更低，中位生存期也較低;反之相反。即METTL3可促進NSCLC的進展，并增加患者預后不良的風險。DU的團隊[23]研究METTL3的SUMO化，發現其可與METTL14和WTAP發生作用，抑制甲基轉移酶活性，使mRNA中m6A甲基化修飾水平下降。同時在NSCLC細胞中發現當METTL3敲除時，可直接影響腫瘤細胞的增殖與轉移。2018年報道在NSCLC中METTL3可與eIF3h發生作用，從而增強翻譯，使癌基因轉化且形成密集多核糖體，這一發現可作為NSCLC潛在的治療靶點。DU等人[24]在前人研究基礎上發現，miR-33a可通過靶向METTL3 mRNA抑制NSCLC的增殖。2021年，有研究報道了METTL3的表達水平對NSCLC患者PD-1抑制劑療效可以作為預測標志物，為NSCLC靶向治療的研究打開了新的大門[25];同年徐朝久等[26]通過收集NSCLC患者癌組織及癌旁組織比較兩組中METTL14含量，發現METTL14在癌組織中表達高，尤其TNM分期較晚且淋巴結轉移的NSCLC組織中METTL14表達更高。

3.2 m6A eraser與非小細胞肺癌

近年來層出不窮關于FTO基因表達與NSCLC的關系的研究。LI等[10]研究發現在人NSCLC組織和細胞系中FTO表達與m6A含量呈負相關;當敲低FTO表達后，NSCLC細胞增殖速度降低;裸鼠實驗同樣發現FTO低表達可降低NSCLC細胞在裸鼠體內的增殖侵襲速度。LIU等[11]研究發現，在過表達野生型及突變型FTO基因中，僅有野生型FTO可以促進NSCLC細胞的生長及侵襲，而突變型由于去甲基化功能的丟失沒有此作用。進一步實驗發現，FTO蛋白可通過降低MZF1 mRNA轉錄本m6A水平及提高MZF1 mRNA的穩定性，可使MZF1高表達，從而促進NSCLC細胞侵襲轉移。此外，該研究還發現FTO基因高表達與肺鱗癌的不良預后有關，肺鱗癌組織中FTO基因高表達患者的總生存期（overall survival，OS）較FTO基因低表達患者短[11]。而BRENNAN等[27]在一項來自中歐和東歐的7000例人群的研究中發現rs9939609等位基因A與肺癌患病風險降低有關。丁雨迪[28]通過從人類蛋白質圖譜門戶網站公布的數據調查及UALCAN數據庫發現，FTO在肺組織中比脂肪組織表達量更高;在NSCLC中，癌旁組織FTO表達高于癌組織，且FTO表達下調后肺腺癌存活率也顯著降低。肺癌發病類型中大部分為NSCLC，研究人員通過對TCGA數據庫分析后確定FTO可作為NSCLC的預后影響因素。后續實驗中敲低FTO基因發現FTO可通過下調MZF1 mRNA甲基化修飾的豐度，增強MZF1的穩定性，促進細胞增殖，誘導肺鱗狀細胞癌發生。也有文獻報道，FTO通過調控USP7 mRNA甲基化修飾豐度促使NSCLC發生[10]。2020年，孫澤龍[29]收集了97對肺癌患者的癌組織及癌旁組織，經分析發現RNA去甲基化酶ALKBH5在癌組織中低表達，后續將ALKBH5與TGFβ1信號通路相聯系，通過過表達和瞬時敲低ALKBH5的方法，驗證了ALKBH5可抑制NSCLC的生長、增殖、侵襲及轉移。在2020年，CHEN等人[13]研究發現PVT1作為ALKBH5靶點介導了ALKBH5在骨肉瘤（osteosarcoma，OS）生長中的致癌性，并提示ALKBH5和PVT1可能成為OS治療的新靶點。

3.3 m6A reader與非小細胞肺癌

現研究發現m6A reader YTHDF1在NSCLC組織和細胞株中均高表達。在NSCLC細胞株中敲低YTHDF1[30]，可使細胞周期蛋白CDK 2、CDK4和cyclinD1的翻譯效率降低，阻滯NSCLC細胞在G0期/G1期，其可明顯抑制NSCLC細胞的惡性增殖[17]。SHI的研究團隊發現與低海拔動物相比，西藏地區的人和哺乳動物的YTHDF1作為高海拔適應基因之一在NSCLC中顯著擴增，并且發現YTHDF1缺失后可調控CDK2、CDK4及cyclinD1的翻譯效率抑制NSCLC增殖及轉移，也可抑制新生肺腺癌（ADC）的進展。總而言之，缺氧適應下YTHDF1在NSCLC發病機制中起關鍵作用[17]。SHENG等[31]發現YTHDF2在NSCLC組織中表達過量，后識別結合磷酸戊糖途徑中的關鍵酶6-PGD 3UTR的甲基化位點，促進其翻譯，加速磷酸戊糖途徑代謝，為NSCLC的增殖提供原材料。2020年，ZHOU等人[18]在研究內皮細胞（ECs）-細胞外囊泡（Evs）釋放的miR-376c對NSCLC發生發展的抑制作用，同時也發現了ECs來源的Evs傳遞miR-376c可以導致YTHDF1的低表達和Wnt/β-catenin通路的阻斷，更進一步證實YTHDF1缺失可以抑制NSCLC細胞增殖和新生肺腺癌的進展。

4 總結

現有研究可以得知，m6A甲基化修飾在多種腫瘤的發生發展預防診斷有著重要的地位。參與m6A甲基化調控的相關蛋白通過基因的剪接、出核、降解和翻譯等過程參與不同惡性腫瘤的發生發展。雖然關于m6A的研究已經越來越完善，但是仍然存在許多未被探索的領域：（1）在哺乳動物或人類的體內是否有未經發現的與m6A甲基化修飾相關的調控蛋白，這些蛋白如何參與在生命活動及m6A的調控中;（2）目前發現的m6A甲基化修飾相關的調控蛋白是經過何種通路，通過什么方式參與到m6A甲基化修飾的調控中，且這些蛋白之間是否產生相互作用，如何作用;（3）除已發現的m6A相關蛋白在NSCLC中的調控作用，還有哪些蛋白參與到NSCLC中的調控中，又分別起到什么作用;（4）關于這些m6A相關蛋白在肺癌中的研究已經頗有成效，但還未有蛋白相關藥物對NSCLC療效研究的報道，其次抗癌藥物耐藥也是一個艱難的探索。

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（收稿日期：2021-07-09 修回日期：2021-11-08）

（編輯：潘明志）