靶向IL-6慢病毒介導RNA干擾實驗性基因治療類風濕關節炎①

孫琳茜 王子葉 王麗芹 李 清 常曉天 王吉波 （青島大學附屬醫院風濕免疫科，青島 266000）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以滑膜關節受累為主要臨床表現的慢性炎癥性系統疾病，發病及發展過程中有多種細胞因子及炎癥介質參與，其中IL-6、TNF-α、IL-1β 等是最重要的致炎因子［1］。RA 有較高致殘率并嚴重影響患者的生活質量，研究者一直在探索其治療方法。目前治療RA 的藥物及方法雖然較多，但仍不能解決全部問題［2-3］。近十年試驗性基因治療業已悄然興起，靶向致炎癥細胞因子的RNA 干擾（RNA interference，RNAi）成為一種新興療法。因為慢病毒具有基因轉導效率高、能夠通過基因整合而實現基因穩定表達等特點，常用作RNAi 的載體。本研究團隊前期已完成慢病毒介導靶向TNF-α 基因RNA 干擾的體外及體內研究，取得了令人振奮的效果［4-5］。本研究再次以慢病毒為載體，以小鼠IL-6 為靶基因，構建RNAi 慢病毒載體顆粒，采用小鼠巨噬細胞株J774A.1細胞與膠原誘導性小鼠關節炎模型（collageninduced arthritis，CIA）分別進行體外、體內試驗，以觀察其作用效果。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠單核巨噬細胞J774A.1（中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心）；DBA/1小鼠（斯萊克實驗動物有限公司，上海）；DMEM 高糖培養基（HyClone，美國）；胎牛血清（fatal bovine serum，FBS，Gibco，美國）；IL-6 siRNA及siRNA scramble陰性對照（吉瑪基因，上海）；lipofectamine3000（Invitrogen，美國）；Trizol、反轉錄試劑盒、qPCR試劑盒（TaKaRa，大連）；引物（生工生物，上海）；GV248 質粒（吉凱基因，上海）；牛Ⅱ型膠原、弗氏完全佐劑（Chondrex，美國）；MTX（輝瑞制藥，美國）；小鼠來源IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA 試劑盒（R&D Systems，美國）；4%多聚甲醛、10%EDTA 溶液（索萊寶，北京）。

1.2 方法

1.2.1 靶向IL-6的RNAi慢病毒顆粒構建

1.2.1.1 細胞培養 用含10%FBS 的DMEM 高糖培養液培養小鼠巨噬細胞J774A. 1，細胞密度達80%~90%時傳代，傳代比例1∶3。取生長狀態良好、對數生長期細胞進行后續實驗。

1.2.1.2 設計、合成、篩選高效siRNA 序列 從Genbank 數據庫中獲取小鼠IL-6 基因mRNA 序列（NM_031168），根據小干擾 RNA（small interference RNA，siRNA）設計原則，合成3對特異性針對IL-6基因的 siRNA 序列（siRNA-1，siRNA-2 和 siRNA-3）及siRNA scramble陰性對照序列（negative control-RNAi，NC-RNAi，表1）。實驗分為siRNA-1組、siRNA-2組、siRNA-3 組，并設NC-RNAi 組、培養基空白對照組。將對數生長期細胞以8×104個/孔接種于24 孔細胞培養板，24 h 后細胞融合達50% 時，利用lipofectamine3000轉染J774A.1細胞。48 h后收集細胞，RT-qPCR檢測siRNA干擾效率。

表1 IL-6 RNAi序列Tab.1 IL-6 RNAi sequences

1.2.1.3 RT-qRCR 檢 測 Trizol 法 提 取 J774A. 1 細胞總RNA，分光光度計測定RNA 濃度，吸光度值（A260/280）均為 1.8~2.0。使用 PrimeScriptTMRT 試劑盒將1 ug 總RNA 逆轉錄獲得cDNA。逆轉錄條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。使用 Premix Ex Tag 試劑盒，采用LightCycler96 PCR儀擴增，反應條件：95 ℃30 s（1 個循環），95 ℃ 5 s 和 60 °C 30 s（40 個循環）。Primer Express 3.0 軟件設計小鼠 IL-6 和 GAPDH 基因引物，引物序列見表2。LightCycler96軟件自動記錄Ct 值，采用2-ΔΔCt方法對數據進行相對定量分析，實驗重復3次。

1.2.1.4 shRNA構建 篩選出siRNA-1為高效IL-6 siRNA 序列：5'-AGAGTCCTTCAGAGAGATA-3'；陰性對照組（NC-RNAi）核心序列：5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。按慢病毒載體構建要求設計、合成寡核苷酸片段，正向單鏈內21 nt的寡核苷酸以正反向組合，中間添加loop結構，使寡核苷酸形成短發卡結構（short hairpin RNA，shRNA），寡核苷酸兩端帶有酶切位點。雙鏈結構序列為：5'-CCGGCCAGAGTCCTTCAGAGAGATACTCGAGTATCTCTCTGAAGGACTCTGGTTTTG-3'，用于構建表達綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的靶向IL-6的 RNAi 慢病毒顆粒（LV-IL-6-RNAi）及陰性對照RNAi慢病毒顆粒（LV-NC-RNAi）。

1.2.1.5 重組慢病毒質粒的構建 寡核苷酸片段退火形成雙鏈DNA 目的片段，GV248 質粒作為工具載體，酶切后與目的片段通過T4連接酶制備載體質粒。載體質粒加入感受態細胞中轉化，經PCR 鑒定選取陽性菌落，2%瓊脂糖凝膠電泳。選取轉化成功的載體質粒PCR 測序檢測進一步驗證。測序正確的單菌落擴增后，去內毒素質粒抽提試劑盒抽提質粒。

1.2.1.6 慢病毒包裝、濃縮純化、感染滴度確定將制備的載體質粒分別與輔助質粒pHelper1.0 和pHelper 2.0共同轉染293T細胞，根據細胞狀態48~72 h后收獲含病毒的上清。4 000 g 離心10 min 除去細胞碎片后以0.45 μm 濾器過濾，4 ℃、25 000 r/min 離心2 h，棄上清后加病毒保存液重懸，4 ℃、10 000 r/min再次離心5 min取上清病毒液分裝。

1.2.2 LV-IL-6-RNAi 轉染J774A. 1 細胞的感染滴度及干擾效率測定 將對數生長期J774A.1細胞用DMEM 高糖完全培養基制備 5×104個/ml 懸液，取100 μl/孔加入96孔板，37 ℃、5%CO2培養箱培養24 h細胞融合度約30%時進行LV-IL-6-RNAi、LV-NC-RNAi病毒感染，用病毒稀釋液將病毒稀釋為1×108TU/ml、1×107TU/ml、1×106TU/ml 3 個濃度梯度，即感染復數（multiplicity of infection，MOI）為1、10、100。每孔加入10μl 病毒液與完全培養基配成100μl 培養體系，培養48~72 h 后熒光顯微鏡觀察表達GFP 細胞數量確定感染滴度。

J774A.1 細胞以 8×104個/孔接種于 24 孔細胞培養板培養 24 h，設 LV-IL-6-RNAi 組、LV-NC-RNAi組、培養基空白對照組，以最佳感染滴度病毒顆粒感染對數生長期J774A.1 細胞，培養96 h，感染效率約80%時，Trizol獲取細胞RNA，RT-qPCR檢測IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA 的相對表達量，引物序列見表2（方法同1.2.1.3）。

表2 RT-qPCR引物序列Tab.2 RT-qPCR primer sequences

1.2.3 LV-IL-6-RNAi治療CIA療效觀察及測定

1.2.3.1 小鼠CIA 模型構建及CIA 關節炎評分牛Ⅱ型膠原于0.1 mol/L 冰醋酸充分溶解，配成濃度為2 mg/ml 溶液，4 ℃冰箱保存過夜后與等體積弗氏完全佐劑充分混合乳化。第1天每只小鼠尾根部分3點皮內注射乳劑0.1 ml，第21天以同樣方法、相同劑量第2 次加強免疫注射［6］。免疫結束后每日觀察小鼠關節炎情況，隔日進行CIA 關節炎評分。評分標準如下：0分，正常爪；1分，1趾紅腫；2分，＞1個趾紅腫，但未累及全爪，或全爪中度腫脹；3 分，全爪紅腫；4 分，關節重度紅腫或強直。四爪總分為該小鼠CIA 評分［7］。

1.2.3.2 LV-IL-6-RNAi 治療 CIA 的療效 第 2 次加強免疫注射前24 h，CIA 模型小鼠隨機分為CIA-LV-IL-6-RNAi組、CIA-LV-NC-RNAi組、CIA-MTX組、CIA-PBS空白對照每組7只，并設健康對照組。分別向小鼠關節腔內注射LV-IL-6-RNAi（1×106TU/ml）、LV-NC-RNAi（1×106TU/ml），腹腔注射MTX（1 mg/kg）、等體積PBS，健康小鼠腹腔注射等體積PBS，每周3次。

首次免疫注射后第42天（注射LV-IL-6-RNAi等處理后第21 天）麻醉小鼠行心內穿刺取血，ELISA法檢測小鼠血清IL-6、TNF-α 及IL-1β 水平。取關節組織置于4%多聚甲醛4 ℃固定過夜，隨后在pH7.4的10%EDTA 溶液中4 ℃保存2周，脫鈣，石蠟包埋，切片（4μm），室溫染色（蘇木精5 min、伊紅30 s），光學顯微鏡下觀察。

1.3 統計學分析 使用GraphPad Prism 8.0 軟件進行數據分析。所得計量資料用表示。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one-way analysis of variance，one-way ANOVA），P＜0.05 為差異有統計學意義。所有細胞實驗至少重復3次，每組樣本均設3個復孔。

2 結果

2.1 IL-6 RNAi慢病毒顆粒構建

2.1.1 高效siRNA 序列篩選 分別用siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、NC-RNAi 轉染 J774A. 1 細胞，并設培養基空白對照組，RT-qPCR 檢測結果顯示：3 組siRNA-IL-6 的IL-6 mRNA 相對表達量均明顯低于NC-RNAi 組和空白對照組，siRNA-1 的干擾效率達80.00%，siRNA-1 組IL-6 mRNA 相對表達量顯著低于siRNA-2和siRNA-3（F=58.74，P＜0.01，圖1）。

圖1 各組IL-6 mRNA相對表達水平Fig.1 IL-6 mRNA relative expression in each group

2.1.2 shRNA、重組慢病毒質粒及目的基因的序列測定 PCR 鑒定感受態細胞中轉化的載體質粒，選取陽性菌落，行2%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示鑒定組分子量略高于空載質粒對照組，說明轉化成功（圖2）。PCR測序顯示插入的針對IL-6基因的siRNA核苷酸序列正確（圖3），結果表明成功構建了沉默IL-6基因的慢病毒載體。

圖2 重組慢病毒質粒PCR產物電泳圖Fig.2 Electrophoregram oflentiviralplasmid PCR products

圖3 重組慢病毒質粒PCR測序Fig.3 Sequencing of recombinant lentivirus plasmid by PCR

2.2 LV-IL-6-RNAi 感染J774A. 1 細胞的病毒滴度及干擾效率測定 LV-IL-6-RNAi感染J774A.1細胞的滴度 MOI 分別為 1、10、100 時，200 倍顯微鏡下觀察顯示，J774A.1細胞表達GFP數占總細胞數分別為（72.56±2.19）%、（85.89±2.45）%、（47.65±2.06）%，MOI 為10 時感染效率顯著高于其他組（F=70.57，P＜0.01，圖4）。以最佳感染滴度LV-IL-6-RNAi感染對數生長期J774A. 1 細胞，IL-6 mRNA 相對表達量顯著低于LV-NC-RNAi 組及培養基空白對照組（F=33.47，P＜0.01）。IL-1β 和TNF-α mRNA 相對表達差異無統計學意義（P＞0.05，圖5）。

圖4 LV-IL-6-RNAi感染J774A. 1細胞不同MOI值時GFP表達情況（×200）Fig.4 Expression of GFP in J774A. 1 cells infected by LV-IL-6-RNAi with different MOI（×200）

圖5 LV-IL-6-RNAi 及 LV-NC-RNAi 感染 J774A.1 細胞后IL-6、IL-1β及TNF-α mRNA相對表達Fig.5 Relative expressions of IL-6，IL-1β and TNF-α mRNA in J774A. 1 cells infected with LV-IL-6-RNAi and LV-NC-RNAi

2.3 LV-IL-6-RNAi治療CIA的效果

2.3.1 小鼠CIA 模型的構建 注射Ⅱ型膠原及弗氏完全佐劑混合乳化液后第28~35 天，小鼠出現關節紅腫、活動受限，多累及后肢足、踝和膝，但前爪也有受累。自第28 天起，關節炎評分顯著提高（t=3.83，P＜0.01，圖6A），成模率為96.43%。CIA 小鼠血清IL-6 水平顯著高于健康對照組（t=14.72，P＜0.01，圖6B）。CIA 小鼠和健康對照組炎癥細胞浸潤數分別為（207.70±11.04）個和（28.00±4.56）個（P＜0.01，圖6C、D）。

圖6 小鼠CIA模型構建情況Fig.6 Construction of CIA mice model

2.3.2 LV-IL-6-RNAi 對CIA 關節炎評分的影響首次免疫注射第35 天后，CIA-LV-IL-6-RNAi 組及CIA-MTX組關節炎評分下降。首次免疫注射第42天，CIA-LV-IL-6-RNAi 組 、CIA-MTX 組 、CIA-LV-NCRNAi 組、CIA-PBS 組關節炎評分分別為（5.00±3.26）分、（5.28±2.22）分、（10.71±2.75）分、（9.86±1.34）分，CIA-LV-IL-6-RNAi 組關節炎評分顯著低于 CIA-LV-NC-RNAi 和 CIA-PBS 組（F=10.05，P＜0.01）。CIA-LV-IL-6-RNAi 組與 CIA-MTX 組之間差異無統計學意義（t=0.19，P=0.85，圖7）。

圖7 各組CIA小鼠關節炎評分Fig.7 Arthritis score of CIA mice in each group

2.3.3 LV-IL-6-RNAi 對 CIA 血 清 IL-6、IL-1β 和TNF-α 的影響 收集小鼠血清，ELISA 檢測結果顯示：正常健康組、CIA-PBS 組、CIA-LV-NC-RNAi 組、CIA-LV-IL-6-RNAi 組和 CIA-MTX 組血清 IL-6 水平分別為（28.37±12.35）pg/ml、（234.3±33.55）pg/ml、（272.7±28.46） pg/ml、（117.40±34.69） pg/ml、（158.60±23.97）pg/ml，CIA-LV-IL-6-RNAi 組 血 清IL-6水平顯著低于CIA-PBS組和CIA-LV-NC-RNAi組（F=87.29，P＜0.01）；CIA-LV-IL-6-RNAi 組與 CIAMTX 組血清IL-6 水平差異無統計學意義（t=2.583，P=0.19，圖8A）。

正常健康組、CIA-PBS 組、CIA-LV-NC-RNAi 組、CIA-LV-IL-6-RNAi 組和 CIA-MTX 組血清 IL-1β 水平分別為（67.50±6.58）pg/ml、（477.4±58.13）pg/ml、（460.0±70.03）pg/ml、（184.3±24.80）pg/ml、（175.7±20.52）pg/ml，CIA-LV-IL-6-RNAi 組血清 IL-1β 水平顯著低于 CIA-PBS 組和 CIA-LV-NC-RNAi 組（F=18.20，P＜0.01）。CIA-LV-IL-6-RNAi 組與CIA-MTX組血清IL-1β 水平差異無統計學意義（t=0.27，P=0.79，圖8B）。

正常健康組、CIA-PBS 組、CIA-LV-NC-RNAi 組、CIA-LV-IL-6-RNAi組和CIA-MTX組血清TNF-α水平分別為（53.58±11.96）pg/ml、（534.10±53.20）pg/ml、（601.00±40.07）pg/ml、（384.30±39.18）pg/ml、（417.80±33.91）pg/ml，CIA-LV-NC-RNAi 組血清 TNF-α 水平亦顯著低于CIA-PBS 組和CIA-LV-NC-RNAi 組（F=30.79，P＜0.01）。CIA-LV-IL-6-RNAi 組與CIA-MTX組血清TNF-α 水平差異無統計學意義（t=0.65，P=0.99，圖8C）。

圖8 各組小鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平Fig.8 Serum IL-6，IL-1β and TNF-α levels of mice in each group

2.3.4 LV-IL-6-RNAi 治療 CIA 對 CIA 關節炎癥細胞浸潤的影響 小鼠踝關節石蠟切片HE染色，400倍鏡下觀察結果顯示：健康組、CIA-PBS 組、CIA-LVNC-RNAi 組、CIA-LV-IL-6-RNAi 組和 CIA-MTX 組炎癥細胞浸潤數分別為（24.71±7.04）個、（173.00±17.14）個、（187.00±13.67）個、（91.71±18.03）個、（97.29±15.10）個，CIA-LV-IL-6-RNAi組和CIA-MTX組炎癥細胞的浸潤數量均顯著少于CIA-LV-NC-RNAi組和 CIA-PBS 組（F=141.80，P＜0.01），而 CIA-LVIL-6-RNAi 組和CIA-MTX 組差異無統計學意義（t=0.63，P=0.54，圖9）。

圖9 各組小鼠踝關節切片HE染色和炎癥細胞浸潤數Fig.9 HE staining of ankle joint and number of infiltrating inflammatory cells of mice in each group

3 討論

基因治療已成為RA 最有前景的治療手段之一［8］。RNAi 涉及序列特異性轉錄后基因沉默，已成為一種主要的基因治療方法［9］。RNAi 通過轉染瞬時作用的siRNA 或通過載體導入穩定的shRNA 實現。RNAi 治療的關鍵，是根據靶細胞選擇適當靶點、載體及構建高效的RNAi載體顆粒。

IL-6 是RA 發生、發展中主要促炎細胞因子，活化巨噬細胞是產生IL-6 的主要細胞，因此本文擬以巨噬細胞作為靶細胞、IL-6 作為治療靶點［10-15］。國外研究者用siRNA脂質復合體特異性沉默IL-6治療CIA取得了令人鼓舞的結果［16］。本文擬通過導入穩定的shRNA，長期干擾巨噬細胞表達IL-6 而達到抗炎治療作用。目前有多種載體用于攜帶shRNA，而慢病毒在多種細胞系中具有基因轉導效率高、外源基因穩定整合、長期表達、細胞毒性低的特點，已成功作為載體用于基因治療［17］。單核巨噬細胞、神經元細胞、胰腺細胞等是比較難以轉染或感染的細胞系，目前常用的腺病毒載體對其感染率低，而慢病毒可轉染或感染單核巨噬細胞系，因此本研究以慢病毒為載體，構建LV-IL-6-RNAi，進行體外和體內研究。

為確保IL-6 被特異性有效抑制，本研究設計并合成3 對針對IL-6 基因的siRNA 序列以及siRNA 陰性對照序列，采用巨噬細胞株J774A.1 檢測其敲低效率，結果顯示3 對針對IL-6 基因的siRNA 在J774A.1細胞中均能有效沉默IL-6基因，但靶向IL-6基因的 siRNA 不影響 J774A. 1 細胞 IL-1β 和 TNF-α mRNA 表達，說明在體外J774A. 1 細胞水平，通過siRNA轉染瞬時作用，RNAi具有有效性及特異性［18］。篩選出敲低效率最高（80.00%）的IL-6 siRNA 序列，構建shRNA、重組慢病毒質粒、測序檢測驗證后抽提質粒，并進行慢病毒包裝，構建LV-IL-6-RNAi 病毒顆粒，穩定沉默IL-6 并表達直接呈現病毒感染能力的GFP。為檢測LV-IL-6-RNAi 的安全性和更好把握LV-IL-6-RNAi 病毒顆粒小鼠體內注射劑量，在體外J774A. 1 細胞水平進行病毒顆粒滴度梯度實驗，明場下觀察，感染滴度為1×108TU/ml的高滴度病毒感染72 h 后J774A. 1 細胞密度仍＞90%，說明LV-IL-6-RNAi 具較好的安全性。暗場下觀察，表達GFP的J774A.1細胞在1×107TU/ml感染滴度下占比最高，說明該滴度下LV-IL-6-RNAi感染能力最佳。

以慢病毒最佳感染滴度感染J774A. 1 細胞，LV-IL-6-RNAi組IL-6 mRNA相對表達水平顯著低于LV-NC-RNAi組和培養基空白對照組，IL-1β和TNF-α mRNA 相對表達差異無統計學意義（P＞0.05），再次說明體外J774A.1細胞水平通過載體導入穩定shRNA（LV-IL-6-RNAi）靶向 IL-6 的 RNAi 效果及特異性較好。RUBIN 等［19］利用不同病毒載體進行實驗性基因治療證實，慢病毒載體治療脫靶效應低于其他病毒載體，結合本研究結果，再次提示慢病毒是一種針對巨噬細胞的高效實用性載體。以上結果表明，通過轉染瞬時作用的siRNA 及通過載體導入穩定的shRNA（LV-IL-6-RNAi）在分子水平上實現了對巨噬細胞的RNAi作用。

CIA 在臨床表現、免疫病理等方面與人RA 類似，因而RA體內實驗性基礎研究以CIA作為研究對象。注射Ⅱ型膠原及弗氏完全佐劑混合乳化液后第28~35天，從關節表現、關節病理、血清學方面，均提示建模成功（成模率達96.43%），可用于體內研究。

MTX 作為治療RA 的重要藥物，療效確切，因而被作為陽性對照；治療局部關節炎癥理應首選關節腔內注射，但小鼠關節腔狹小，MTX 關節腔注射劑量相對較大，因此選擇MTX 腹腔注射可能更優于關節腔注射［20-22］。

CIA 模型小鼠二次加強免疫注射前（首次免疫注射后第21 天），分別向4 各組小鼠對應部位注射LV-IL-6-RNAi、LV-NC-RNAi、MTX、PBS 溶液，健康小鼠腹腔注射PBS，首次免疫注射后第28 天，CIA-LV-IL-6-RNAi組和CIA-MTX組關節炎評分增幅減弱；首次免疫注射后第35 天，CIA-LV-IL-6-RNAi組和CIA-MTX 組關節炎評分開始降低，關節炎評分隨時間而緩慢降低至首次免疫注射后第42天，而陰性對照、空白對照組的關節評分持續提高。提示LV-IL-6-RNAi 治療1 周內起效，持續時間至少2 周以上。首次免疫注射后第42天，麻醉小鼠行心內穿刺取血，檢測小鼠血清IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平，處死小鼠進行病理檢查。CIA-LV-IL-6-RNAi 組和CIA-MTX 組血清 IL-6、IL-1β、TNF-α 水平及受累關節炎癥細胞浸潤數均顯著低于陰性對照、空白對照。CIA-LV-IL-6-RNAi 組與CIA-MTX 組在關節評分、血清細胞因子水平、受累關節炎癥細胞浸潤數三方面差異均無統計學意義，說明LV-IL-6-RNAi 與1 mg/kg 的MTX 療效相當。本研究從關節表現、血清細胞因子水平、關節病理上，均證實LV-IL-6-RNAi治療CIA的有效性，為RNAi技術從試驗到臨床提供了有力支持。考慮到CIA 存活時間問題，本研究的LV-IL-6-RNAi 治療觀察時間僅為3 周，需后續研究探索其長期療效。與傳統藥物相比，慢病毒基因治療無需反復多次應用。另外，在體內CIA 動物水平方面，LV-IL-6-RNAi 雖然特異性干擾IL-6 表達，但由于細胞因子網絡因素，同樣也間接影響其他炎癥因子如IL-1β和TNF-α表達，與體外J774A.1細胞水平RNAi方面特異性不同。

LV-IL-6-RNAi 實驗基因治療RA 可行且有效。雖然RNAi 治療在基因水平發揮作用，與新興的針對細胞因子的生物制劑在蛋白水平進行調控相比具有一定優勢，但目前RNAi 治療仍處于試驗階段，仍需大量基礎和臨床研究方能夠應用于臨床。希望不久的將來，LV-IL-6-RNAi能夠盡快從試驗走向臨床，為RA患者提供安全有效的治療。