紫草素通過p38 MAPK 信號通路改善咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮膚炎癥反應(yīng)①

郭譯濛 周明明 郭晉榮 慕珍珍 徐媛媛 耿 龍 （中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，沈陽 110001）

銀屑病是一種免疫介導(dǎo)的以紅斑、鱗屑為主要臨床表現(xiàn)的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病，其主要病理表現(xiàn)為角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖和炎癥細(xì)胞浸潤，全球患病率為2%~5%，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量和心理狀態(tài)［1-2］。研究表明絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路參與角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、分化及凋亡，其中p38 MAPK 信號通路與炎癥關(guān)系最為密切，在銀屑病發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，且活化的MAPK 信號通路可促進(jìn)炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α 等釋放，提高銀屑病患者皮損嚴(yán)重程度［3-5］。

紫草素是從中國傳統(tǒng)中藥“紫草”根莖中提取的一種萘醌類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤及促進(jìn)傷口愈合等作用［6-7］。越來越多證據(jù)表明，中藥對銀屑病均有較為顯著的治療效果［8］。研究發(fā)現(xiàn)紫草素可通過作用于MAPK 信號通路調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，減輕D-半乳糖誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥［9］。課題組前期研究表明，紫草素可通過抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡治療銀屑病［10］。基于以上研究背景，本研究建立咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠模型，旨在從p38 MAPK 信號通路角度探索紫草素對銀屑病的治療作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF 級6~8 周齡雄性BALB/c小鼠，體質(zhì)量16~20 g，均購自遼寧長生生物科技有限公司，許可證號：SCXK（遼）2020-0001。

1.1.2 主要試劑 紫草素購自南京廣潤生物制品有限公司；5%咪喹莫特乳膏（Imiquimod，IMQ）購自四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司；Anti-p38 抗體購自美國 Abcam 公司；p-p38 抗體購自美國 CST 公司；BCA試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器 低溫超速離心機(jī)、Fast Real-time PCR儀購自美國Thermo 公司；酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tek公司；自動切片機(jī)購自德國Leica 公司；光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 動物造模、分組與處理 6~8周齡BALB/c雄性小鼠剔除背部正中毛發(fā)，面積約2 cm×3 cm，備皮后隨機(jī)分為5組：空白對照組（CON）、咪喹莫特模型組（IMQ）、紫草素低［5 mg/（kg·d）］、中［7.5 mg/（kg·d）］和高劑量組［10 mg/（kg·d）］。處理組小鼠給予5%IMQ乳膏（62.5 mg/只），1 次/d，連續(xù)7 d 建立銀屑病樣小鼠模型，對照組給予等劑量凡士林。將紫草素溶于食用油后灌胃給予相應(yīng)處理組小鼠，同時對照組和模型組給予食用油［1 mg（/kg·d），含5%DMSO 的食用油］。小鼠每日給藥前拍照、稱重，觀察并記錄小鼠背部皮損動態(tài)變化。

1.2.2 小鼠銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）評分 按照PASI 評分從鱗屑、紅斑、增厚程度三個方面對小鼠背部皮損嚴(yán)重程度進(jìn)行評分（0 分：無皮損；1 分：輕度皮損；2 分：中度皮損；3 分：重度皮損；4 分：極重度皮損），三者分?jǐn)?shù)相加即為累積分?jǐn)?shù)，記錄并繪制評分趨勢圖。

1.2.3 小鼠皮損HE染色 第8天以頸脫位法處死小鼠，留取相應(yīng)皮損組織固定于10%中性甲醇中，脫水、石蠟包埋，制備5μm 切片并進(jìn)行HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察皮損組織病理學(xué)改變。

1.2.4 Western blot 檢測皮損中p-p38 蛋白表達(dá)研磨組織后加入適量含蛋白磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液冰上裂解20 min，4 ℃、15 000 r/min 離心15 min，收集上清，分裝，BCA 蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。10%SDS-PAGE電泳（濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V），200 mA 恒流轉(zhuǎn)膜40 min，加入快速封閉液室溫封閉15 min，分別加入適量抗p38 MAPK（1∶1 000）、p-p38 MAPK（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）一抗稀釋液4 ℃輕搖過夜，洗膜后二抗室溫孵育2 h，洗膜，加入ECL 化學(xué)發(fā)光液曝光顯影，Image J圖像分析軟件分析條帶灰度值。

1.2.5 免疫組化法檢測皮損組織中p-p38 蛋白表達(dá) 制備石蠟切片，常規(guī)脫蠟、脫水、抗原修復(fù)，加入 3%H2O2室溫孵育 15 min，PBS 清洗，室溫封閉30 min，加入50μl 1∶100稀釋的p-p38一抗4 ℃避光孵育過夜，復(fù)溫45 min 后PBS 清洗，二抗室溫孵育45 min，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染15 s。光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取3個中心視野拍照，Image-Pro6.0軟件進(jìn)行評估。

1.2.6 qRT-PCR 檢測皮損中 IL-6、IL-1β 和 TNF-α表達(dá) 采用TRIzol 法提取皮損組織總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測mRNA 濃度，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板采用SYBR Green 法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。引物序列GAPDH F：5'-GGGCTCTCTGCTCCTCCCTGT-3'，R：5'-CGGCCAAATCCGTTCACACCG-3'；IL-6 F：5'-CTGCAAGAGACTTCCATCCAG-3'，R：5'-AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG-3'；IL-1β F：5'-GAAATGCCACCTTTTGACAGTG-3'，R：5'-TGGATGCTCTCATCAGGACAG-3'；TNF-α F：5'-CAGGCGGTGCCTAT-GTCTC-3'，R：5'-CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG-3'，退火溫度為60 ℃，重復(fù)3次，2-ΔΔCt計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析（One Way ANOVA），P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫草素可改善IMQ 誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮損 與對照組相比，模型組小鼠背部皮膚第8 天明顯增厚，并出現(xiàn)典型紅斑、鱗屑。紫草素連續(xù)治療7 d后，紫草素治療組小鼠銀屑病樣皮損較模型組顯著改善，紫草素高劑量組改善最為顯著（圖1）。對照組小鼠體質(zhì)量無明顯變化，模型組和紫草素治療組小鼠體質(zhì)量較對照組明顯減輕（P＜0.01），且紫草素治療組小鼠體質(zhì)量變化幅度低于模型組（P＜0.05，圖2A）。PASI 評分趨勢圖可見模型組小鼠于第2 天出現(xiàn)明顯皮損，而后逐漸加重并于第6~7 天達(dá)到高峰。第7天時紫草素各治療組紅斑、鱗屑、浸潤程度及總評分與模型組相比顯著降低（P＜0.01），但紫草素中、高劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖2B~E）。

圖1 各組小鼠第8天背部皮損表現(xiàn)Fig.1 Back skin lesions of mice in each group at 8 d

圖2 各組小鼠體質(zhì)量及皮損PASI評分Fig.2 Body weight and PASI scores of mice skin lesions in each group

2.2 HE 染色觀察各組小鼠組織病理學(xué)變化 HE染色顯示對照組小鼠表皮薄，皮下炎癥細(xì)胞浸潤少，而模型組小鼠呈現(xiàn)明顯銀屑病樣改變，包括表皮增厚、炎癥細(xì)胞浸潤、角化不全伴角化過度，且可見大量Munro 微膿腫，測量結(jié)果顯示模型組小鼠背部皮損的垂直表皮厚度約為對照組6.7 倍（P＜0.001）。與模型組相比，紫草素治療組小鼠表皮增厚程度明顯減少，炎癥細(xì)胞浸潤及Munro 微膿腫減輕（P＜0.01），但紫草素中、高劑量組小鼠表皮厚度及炎癥細(xì)胞浸潤程度無顯著差異（圖3）。表明紫草素可有效抑制IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮炎。

圖3 各組小鼠背部皮膚的組織病理表現(xiàn)（HE，×200）Fig.3 Histomorphology manifestations of back skin of mice in each group（HE，×200）

2.3 紫草素抑制IMQ 誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮損中p-p38 蛋白表達(dá) Western blot 結(jié)果表明，模型組p38 MAPK 蛋白磷酸化水平較空白對照組顯著升高（P＜0.001）。IMQ誘導(dǎo)的小鼠經(jīng)紫草素治療后，p-p38蛋白表達(dá)隨給藥濃度升高逐漸降低，紫草素低、中、高劑量組p-p38 蛋白表達(dá)分別降低89.9%、76.7%和50.3%（P＜0.01，P＜0.001，圖 4）。免疫組化結(jié)果顯示，與空白對照組相比，IMQ 誘導(dǎo)的小鼠皮損p-p38 在表皮廣泛表達(dá)，呈現(xiàn)明顯親核傾向，呈深棕色（P＜0.001）。與模型組相比，紫草素治療組小鼠皮損組織中p-p38 表達(dá)明顯下降，顏色變淺（P＜0.01，P＜0.001，圖5）。

圖4 Western blot 檢測紫草素對p-p38表達(dá)的影響Fig.4 Effect of shikonin on expression of p-p38 detected by Western blot

2.4 紫草素降低小鼠背部皮損中IL-6、IL-1β 和TNF-α mRNA 表達(dá) qRT-PCR 檢測小鼠背部皮損中IL-6、IL-1β 和TNF-α mRNA 表達(dá)，結(jié)果顯示，模型組促炎細(xì)胞因子 IL-6、IL-1β 和 TNF-α mRNA 水平較對照組顯著升高，分別提高5.5、9.4 和9.4 倍。紫草素處理后，IL-6、IL-1β 和 TNF-α mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.01，P＜0.001，圖6）。表明紫草素可能通過抑制p38 MAPK 信號通路調(diào)節(jié)下游蛋白及炎癥因子表達(dá)，從而改善小鼠銀屑病樣皮膚炎癥。

圖6 紫草素對IL-6、IL-1β和TNF-α mRNA表達(dá)的影響Fig.6 Effects of shikonin on IL-6，IL-1β and TNF-α mRNA expressions

3 討論

本研究旨在探討紫草素對咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮膚炎癥的影響及潛在作用機(jī)制。局部采用咪喹莫特可使小鼠皮膚發(fā)生銀屑病樣改變，目前已被廣泛用于銀屑病發(fā)病機(jī)制研究［11-12］。本實(shí)驗(yàn)選用5%咪喹莫特乳膏誘導(dǎo)銀屑病小鼠模型，結(jié)果表明紫草素可有效緩解小鼠皮損紅斑、鱗屑及增厚程度，降低PASI評分，且呈劑量依賴性。HE 染色結(jié)果表明紫草素可抑制角質(zhì)形成細(xì)胞角化、減少炎癥細(xì)胞浸潤。提示紫草素對小鼠銀屑病樣皮膚炎癥有顯著抑制作用。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）可調(diào)節(jié)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，在銀屑病發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。MAPK家族包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、c-JunN 末端激酶（JNK）和p38［13］。研究發(fā)現(xiàn) MAPK 被激活后易位至細(xì)胞核，使多種轉(zhuǎn)錄因子和靶蛋白磷酸化，從而調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，且p-p38 表達(dá)在銀屑病皮損中顯著升高［14-16］。本研究顯示，模型組p-p38 表達(dá)顯著升高，給予紫草素可有效抑制小鼠皮損中p-p38表達(dá)。同時，SOEGAARD-MADSEN等［17］證明阿達(dá)木單抗主要通過抑制p38 活性下調(diào)p38 調(diào)節(jié)的炎癥因子表達(dá)治療銀屑病，與本研究結(jié)果一致，表明紫草素可能通過抑制p38 MAPK 信號通路發(fā)揮抗炎作用。

為研究紫草素對銀屑病小鼠模型中促炎細(xì)胞因子的影響，采用qRT-PCR 檢測皮膚組織中IL-6、IL-1β 和 TNF-α 表達(dá)。大量研究證明 IL-6、IL-1β 和TNF-α 在銀屑病病變組織和血清中高表達(dá)，且與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)［18-19］。p38 MAPK 被激活后可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，募集IL-6 等炎癥因子在皮損處聚集形成正反饋，進(jìn)一步加速疾病發(fā)展［20］。INOUE 等［21］研究發(fā)現(xiàn)紫草素可抑制系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血液中IL-6、TNF-α 等炎癥因子分泌。本研究通過對咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠研究證明，紫草素同樣可抑制促炎細(xì)胞因子 IL-6、IL-1β 和 TNF-α mRNA上調(diào)。

本研究表明紫草素可改善咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮膚炎癥，抑制p38 MAPK 磷酸化并下調(diào) IL-6、IL-1β 和 TNF-α 表達(dá)。綜上所述，紫草素可能通過干預(yù)p38 MAPK 信號通路發(fā)揮保護(hù)作用，在治療銀屑病方面具有很大潛力，但仍需在臨床樣本上進(jìn)行進(jìn)一步研究，以便更完整地探索紫草素的作用，為紫草素治療銀屑病奠定理論基礎(chǔ)。