高表達Gal-9的肝癌血漿外泌體誘導自然殺傷細胞功能失調的機制研究①

姚琳芳 王菊英 蘇 明 紀婷婷 劉瑤瑤 周 每 （寧夏醫科大學總醫院醫學實驗中心，銀川 750004）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是導致全球癌癥相關死亡原因的主要惡性腫瘤之一，其發病率及病死率較高，嚴重威脅人類健康［1］。盡管近年HCC 診斷與治療均取得快速進展，但由于HCC復發率及耐藥性較高等，HCC 患者五年生存率仍不理想，急需研究者積極探索新的肝癌治療策略［2］。

近年免疫治療備受關注，而肝癌細胞能夠通過多種機制促進腫瘤發生免疫耐受，從而逃避機體免疫監控及殺傷，最終導致腫瘤不斷進展，因此，積極深入探究肝癌誘導機體免疫耐受的相關機制具有重要意義［3］。外泌體是由雙層磷脂分子包裹的囊泡樣小體，直徑40~200 nm，廣泛存在于血液、尿液及腹水等多種體液中。近年越來越多研究證實，外泌體通過其內包含母體細胞蛋白、DNA、mRNA/miRNA/lncRNA、脂類等多種生物活性成分在腫瘤細胞增殖、免疫逃逸及播散轉移等過程中發揮重要作用［4］。半乳糖凝集素-9（galectin-9，Gal-9）屬半乳糖凝集素家族，其作為T 細胞免疫球蛋白和黏附因子3（T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein-3，Tim-3）配體，廣泛存在于生物體內，且參與調控細胞生長、凋亡、胚胎發育及腫瘤免疫逃逸等多種生理病理過程［5-6］。NK 細胞是先天免疫系統的效應淋巴細胞，也是體內抵御腫瘤的第一道防線。HCC 發展過程中，NK 細胞功能缺陷與疾病進展高度相關，同時也是導致腫瘤細胞免疫逃逸的重要原因［7］。最新數據證實，HCC 患者外周血NK 細胞表面Tim-3表達顯著增加，可能與患者腫瘤分期、臨床預后等密切相關［7］。研究顯示，Tim-3/Gal-9 信號通路參與腫瘤細胞免疫逃逸［8］。而外泌體作為一種重要的傳播媒介是否參與HCC 免疫逃逸尚未闡明。本研究將通過檢測Gal-9 在HCC 血漿外泌體中的表達，探究其對NK 細胞功能的影響及相關機制，以進一步闡明HCC誘導免疫逃逸的分子機制。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床樣本 選取2018年9月至2019年10月寧夏醫科大學總醫院普外科行根治性肝癌切除術的10 例HCC 患者（HCC 組），組織樣本經臨床診斷及術后病理學證實為HCC。其中男性8 例，女性2 例，平均年齡（54.1±4.3）歲；乙肝病毒表面抗原陽性（HBsAg）者 7 例，陰性 3 例；腫瘤直徑≥5 cm 者4 例，＜5 cm 者 6 例；Chid-Pugh 系統分級：A 級 6 例，B~C級4例；另選寧夏醫科大學總醫院體檢中心體檢者10 例，結果正常的患者作為正常對照組（NC 組），其中男性 8 例，女性2 例，平均年齡（53.8±4.1）歲，兩組患者性別、年齡差異無統計學意義（P＞0.05）。納入標準：①HCC 組為臨床資料完整的接受根治性治療的原發性HCC 患者；②所有患者血、尿、糞常規及腎功能、心電圖等檢查均正常，NC 組肝功能檢查正常；③HCC 患者術前均未接受放療、化療、免疫等其他抗腫瘤治療；④所有患者未合并心腦血管、呼吸系統、內分泌等其他器官或組織疾病。取兩組患者晨起空腹靜脈血5 ml 提取血漿外泌體。本研究獲得寧夏醫科大學總醫院倫理委員會批準，患者知情同意。

1.1.2 主要試劑 人肝癌細胞細胞系HepG2 購自中國科學院上海細胞庫；RPMI1640、DMEM/HG、0.25%胰蛋白酶（美國Hyclone 公司）；TRIzol 試劑（美國Invitrogen公司）；胎牛血清（FBS）、青鏈霉素混合液（100 U/ml，杭州四季青生物公司）；外泌體蛋白提取試劑盒（Thermo）；人重組Gal-9（美國R＆D公司）；淋巴細胞分離液（美國Sigma 公司）；MACS NK 細胞分離試劑盒（德國Miltenyi biotec 公司）；小鼠抗人Tim-3-FITC、小鼠抗人IFN-γ-APC、CD56-FITC、小鼠抗人 CD3-APC（美國 Biolegend）；Annexin V 凋亡檢測試劑盒（江蘇碧云天）；PCR 試劑盒（日本TaKaRa公司）；PCR 引物由上海生工合成，其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 血漿外泌體分離及鑒定 取收集的外周血，800 g 離心10 min，取500 μl 上層血清，按照外泌體分離試劑盒說明分離血清外泌體，3.5%多聚甲醛固定，滴加至銅網，2%鈾酸鹽染色，晾干，透射電鏡（transmission electron microscopy，TEM）觀察外泌體形態；PBS 按 100∶1 稀釋適量外泌體，0.22 μm 濾膜過濾，Nanosight 納米粒徑顆粒跟蹤分析儀（Nano-Sight particle tracking analysis，NTA）檢測外泌體粒徑；Western blot 檢測外泌體特征蛋白CD81、CD63表達。

1.2.2 NK 細胞分離及Tim-3 表達 取外周血離心后所得細胞沉淀，重懸于5 ml RPMI1640，將其鋪于等體積淋巴細胞分離液面，于緩升緩降的離心機中2 000 r/min 離心30 min，吸取中間層“云霧狀”單個核細胞，NK 細胞即位于其內。參考MACS NK 細胞分離試劑盒說明分離上述單個核細胞中的NK 細胞，PBS洗滌，流式洗液重懸細胞，細胞計數，依次加入 CD56-FITC、CD3-APC、Tim-3-PE 流式抗體檢測兩組患者外周血NK細胞中Tim-3表達。

1.2.3 細胞培養及分組 常規復蘇HepG2 細胞，采用含10%FBS、1%青鏈霉素的RPMI1640 培養液于37 ℃、5%CO2培養。待細胞生長至80%~90%融合時，0.25%胰酶進行消化傳代。按NC 組NK 細胞處理條件不同將其分為2 組：Gal-9 組（2 μg/ml 人工重組Gal-9 處理）；PBS 組（等體積PBS 處理），培養24 h后用于后續實驗。

1.2.4 流式細胞術 細胞表面分子檢測：取待測細胞，計數，PBS稀釋，加入適量CD56-FITC、CD3-APC、Tim-3-PE 和 IFN-γ-APC 流式抗體進行標記，4 ℃避光孵育30 min，對照管加入同型對照抗體，300 目濾膜過濾細胞團塊，流式細胞儀檢測，實驗重復3 次。Annexin V 凋亡實驗：取上述 2 組細胞，800 g 離心5 min，棄上清，4 ℃預冷PBS 洗滌2 次，按上述方法離心，收集細胞沉淀，195μl Annexin V-FITC 結合液重懸細胞，計數，輕輕搖晃離心管充分混勻，4 ℃避光孵育30 min。按前述方法過濾后上機分析，實驗重復3次。

1.2.5 LDH 釋放法檢測NK 細胞殺傷活性 取生長狀態良好的HepG2 細胞（靶細胞），以NK 細胞為效應細胞。按照NK 細胞殺傷活性檢測試劑盒說明進行LDH 釋放實驗：將分離純化的NK 細胞與HepG2 細胞分別調整至 5×104個/孔與 1×104個/孔，接種至96 孔板作為實驗孔；設置分別含1×104個/孔或5×104個/孔的靶細胞或效應細胞作為靶細胞或效應細胞自發釋放孔；另設含1×104個/孔靶細胞的培養液（孵育結束45 min 前加入10μl lysis solution）作為靶細胞最大釋放孔。上述每孔均含10%FBS 的RPMI1640 培養液 100 μl，37 ℃、5%CO2共培養 4 h，收集上清。取適量上清按1∶1 加入底物，室溫避光反應30 min，加入等體積終止液于490 nm 處檢測各孔吸光度值（OD 值）。以上各組均設5 個復孔，NK 細胞殺傷活性（%）=（OD實驗孔-OD效應細胞自發釋放-OD靶細胞自發釋放）（/OD靶細胞最大釋放-OD靶細胞自發釋放）×100%。檢測Gal-9 處理后對NK 細胞殺傷活性的影響時，預先將NK 細胞置于終濃度為2μg/ml 的Gal-9 或等體積PBS 中4 ℃孵育30 min，再將NK 細胞與靶細胞進行共培養，并按上述方法進行檢測。

1.2.6 Western blot 4 ℃預冷的PBS 洗滌細胞，加入RIPA 細胞裂解液及蛋白酶抑制劑提取細胞總蛋白。外泌體中總蛋白采用外泌體蛋白提取試劑盒提取。BCA 法進行蛋白定量，并于沸水中加熱變性10 min。取30 μg 蛋白進行SDS-PAGE 分離，濕轉法轉至PVDF 膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入CD63（1∶300）、CD81（1∶300）、Gal-9（1∶300）、p-JNK（1∶500）、JNK（1∶500）、Cleaved Caspase-3（1∶800）、Caspase-3（1∶800）、GAPDH（1∶1 000）一抗4 ℃搖床孵育過夜。TBST 清洗3 次，5 min/次，加入辣根酶標記的二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST 清洗 3 次，5 min/次。均勻滴加ECL 發光液后于凝膠成像儀曝光拍照，Image J 軟件測定條帶灰度值，以目標蛋白與內參GAPDH比值作為其相對含量。實驗重復3次。

1.3 統計學分析 采用 SPSS19.0 和 GraphPad Prism5.0 軟件進行統計學分析，數據以表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Gal-3 在外泌體中的表達 TEM 和 NTA 結果顯示，外泌體呈圓形或橢圓形囊泡結構，直徑約30~150 nm（圖1A、B）。Western blot結果顯示，外泌體標志分子 CD63、CD81 在 NC-Exo 與 HCC-Exo 中均呈高表達，而 Gal-3 在 HCC-Exo 中表達較 NC-Exo 明顯增加（P＜0.01，圖1C）。

圖1 血漿外泌體中Gal-9表達（×200）Fig.1 Gal-9 expression in plasma exosomes（×200）

2.2 外周血NK 細胞Tim-3 表達 流式細胞術檢測兩組受試者外周血NK 細胞Tim-3 表達，結果顯示，與 NC 組相比，HCC 組外周血 NK 細胞 Tim-3 表達顯著增加（P＜0.01，圖2）。

圖2 HCC患者外周血NK細胞Tim-3表達Fig. 2 Tim-3 expression in peripheral blood NK cells of patients with HCC

2.3 Gal-9 對NK 細胞Tim-3 表達及功能的影響與PBS 相比，Gal-9 顯著促進NK 細胞Tim-3 表達（P＜0.05，圖3A）；Annexin V 凋亡實驗結果顯示，與PBS組相比，Gal-9 顯著促進 NK 細胞凋亡（P＜0.05，圖3B）；流式細胞術結果顯示，與PBS 組相比，Gal-9處理后的 NK 細胞 IFN-γ 表達顯著降低（P＜0.05，圖3C）；NK 細胞殺傷活性結果表明，Gal-9 處理后的NK 細胞對HepG2 細胞殺傷能力較PBS 組顯著降低（P＜0.05，圖3D）。

圖3 Gal-9促進NK細胞Tim-3表達及功能損傷Fig.3 Gal-9 promoted expression and functional impairment of Tim-3 in NK cells

2.4 Gal-9 對NK 細胞MAPK 信號通路及凋亡相關蛋白的影響 Western blot 結果表明，與PBS 組相比，Gal-9 處理后的NK 細胞JNK 蛋白磷酸化水平與Cleaved Caspase-3 蛋白表達均顯著升高（P＜0.05，圖4）。

圖4 Western blot 檢測Gal-9 對NK 細胞信號通路及凋亡相關蛋白表達的影響Fig.4 Effect of Gal-9 on expression of signaling pathway and apoptotic proteins in NK cells detected by Western blot

3 討論

Gal-9 是一種具有2 個重復碳水化合物識別區域的半乳糖凝集素，其最初被鑒定為嗜酸性粒細胞趨化及激活因子，隨著研究深入，發現Gal-9 不僅能夠調控細胞黏附、增殖、凋亡等功能，還可通過影響免疫細胞功能介導腫瘤細胞免疫逃逸［9-10］。最近研究發現Gal-9 可與其受體Tim-3 相互作用，促進CD8+T 細胞衰竭，并誘導髓源性抑制細胞增殖負性調控 T 細胞功能［11］。而HBV 感染可顯著促進肝細胞表面Gal-9 表達，從而抑制NK 細胞殺傷活性及分泌功能，誘導免疫耐受，并進一步促進細胞癌變［12］。肝癌患者外周循環中Gal-9 表達與術后患者生存率呈負相關，提示Gal-9 以某種方式影響患者整體免疫狀態［13］。NK 細胞是先天免疫應答系統中的重要功能執行細胞，可發揮類似CD8+細胞毒性T 細胞功能，可直接殺傷感染病原體細胞及腫瘤細胞，而NK細胞不需要抗原提呈，通過自身表面激活或抑制性受體識別環境中的可溶性配體，如細胞因子或細胞在病理條件下呈現的表面抗原分子，并通過整合所接受到的活化及抑制性信號發揮其相應免疫功能［14］。大量研究證實 Gal-9 受體 Tim-3 是廣泛存在于HCC 腫瘤微環境中的明星免疫檢查點分子，最新研究顯示Tim-3 不僅在腫瘤微環境中表達顯著升高，在HCC 外周免疫細胞（如NK 細胞、巨噬細胞、CD8+T 細胞）中表達同樣異常增加，且高表達Tim-3的免疫細胞均出現功能顯著受損現象［15-16］。

外泌體作為腫瘤細胞釋放的并攜帶重要信息分子的載體，介導腫瘤細胞與免疫細胞相互作用，通過不同作用機制抑制免疫細胞分化及功能，最終促進腫瘤發生發展［17］。本研究通過分離HCC 患者與正常人群血漿外泌體發現，HCC 患者Gal-9 表達顯著增加。流式細胞術分析HCC 患者外周血NK 細胞中Tim-3 表達，結果與既往研究一致，Tim-3 在HCC 中的表達較健康人群顯著升高［15］。進一步通過人工重組Gal-9 處理健康人外周血NK 細胞，結果表明Gal-9 能夠顯著促進NK 細胞表面Tim-3 表達，并誘導其凋亡。同時，課題組在探究Gal-9 是否影響NK 細胞對肝癌細胞殺傷能力時發現，Gal-9 可能通過降低NK 細胞IFN-γ 表達降低其對腫瘤細胞的殺傷活性。Western blot 結果發現，Gal-9 能夠通過促進NK 細胞MAPK 信號通路關鍵蛋白JNK 磷酸化水平及凋亡蛋白酶Caspase-3表達而影響NK細胞功能改變。JNK 屬于MAPK 信號傳導通路之一，參與調節體內多種細胞增殖、分化、凋亡等生物學行為。JNK 經磷酸化活化后可進一步激活下游Caspase-3，而凋亡蛋白酶Caspase-3 是細胞中各種凋亡途徑的樞紐分子，也是細胞凋亡的指示劑，其激活表示細胞已進入凋亡早期，并最終導致細胞死亡［18］。不明原因復發性流產研究報道，Gal-9 可通過與Tim-3 相互作用促進孕婦外周循環NK 細胞中JNK 蛋白磷酸化，從而誘導其免疫表型和細胞因子產生，有助于維持母胎界面免疫耐受［19］。

綜上，本研究顯示HCC 血漿外泌體中高表達的Gal-9 能夠促進NK 細胞表面Tim-3 表達，并通過MAPK信號通路誘導NK細胞凋亡，并抑制其對腫瘤細胞的殺傷活性，為Gal-9 在HCC 免疫調節中的作用機制提供了新的見解，但Gal-9 是否通過其他途徑調控免疫系統有待進一步研究。