PM2.5 對慢性阻塞性肺疾病患者巨噬細胞Toll 樣受體表達及吞噬功能的影響①

曾曉麗 施 凱 龐 琪 包海榮 劉曉菊 （蘭州大學第一醫院老年呼吸科，蘭州 730000）

PM2.5是指空氣動力學直徑≤2.5μm 的大氣顆粒物，是大氣污染的重要成分。PM2.5是慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）發病和急性加重的重要危險因素［1］。本研究小組前期研究顯示PM2.5可降低COPD 患者及健康者單核細胞來源巨噬細胞（monocyte derived macrophage，MDM）的吞噬功能，機制有待進一步研究［2］。Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）2 和 TLR4 是巨噬細胞表面重要的模式識別受體，可識別并結合顆粒物上的病原體相關模式分子，啟動TLR 信號通路，介導吞噬和免疫應答［3-4］。因此本文研究PM2.5對COPD患者MDM TLR 表達及吞噬功能的影響，探討PM2.5 致COPD 患者MDM 吞噬功能降低是否與TLR2、TLR4相關。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料 選取蘭州大學第一醫院收治的COPD 急性加重 患 者 14 例，年齡 61~85 歲，符合COPD 診斷標準［5］。選擇同期健康志愿者 14 例作為健康組，年齡60~76 歲。COPD 組與健康組年齡、性別、吸煙者構成比、吸煙指數差異均無統計學意義，兩組一般資料詳見表1。排除合并肺炎、支氣管擴張癥、肺間質纖維化、支氣管哮喘、冠心病、高血壓、糖尿病和惡性腫瘤等疾病患者。本研究經蘭州大學第一醫院倫理委員會批準（LDYYLL2016-0033），研究對象簽署知情同意書。

表1 健康組和COPD組一般資料比較（，n=14）Tab.1 General data comparison between healthy group and COPD group（，n=14）

表1 健康組和COPD組一般資料比較（，n=14）Tab.1 General data comparison between healthy group and COPD group（，n=14）

Note：M.Male；F.Female；FEV1.Forced expiratory volume in 1 s；FVC. Forced vital capacity；%pred. %predicted；1）P＜0.01 vs Healthy group.

FEV1%pred/%90±16 44±131）Groups Healthy COPD Gender（M/F）7/7 9/5 Age/year 70±5 71±7 Smoker number/n 10 11 Smoking index/（package·year-1）28±13 30±15 FEV1/FVC/%84±11 50±131）

1.1.2 試劑與儀器 重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（rhGM-CSF）購自美國RD 公司；qRT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa 公司；TLR4 多克隆抗體、TLR2 單克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司；熒光標記大腸桿菌吞噬試劑盒（FITC-E.coli）購自美國Invitrogen 公司；中流量懸浮微粒采樣器購自武漢天虹儀器廠；PCR 儀購自澳大利亞Cotbett 公司；蛋白電泳、轉印系統及化學發光成像系統購自美國Bio-Rad 公司；激光共聚焦顯微鏡購自日本Olympus公司；流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 PM2.5懸液制備 采集蘭州市區PM2.5，將附著PM2.5 的濾膜剪成1 cm×1 cm 小塊浸于雙蒸水中，超聲振蕩2 h洗脫PM2.5顆粒，紗布過濾，4 ℃離心（10 000 r/min，20 min），棄上清，下層懸混液倒入塑料平皿中冷凍干燥，收集PM2.5，稱重后配制成PM2.5懸液儲存液，滅菌備用。

1.2.2 MDM 培養與分組 抽取受試者肘靜脈血20 ml，參照 TAYLOR 等［6］方法，分離單核細胞，細胞密度調整至 3×106個/ml，接種于 24 孔板，1 ml/孔，置于5%CO2、37 ℃培養箱培養2 h 后棄去未貼壁細胞，貼壁的單核細胞（5×105個/孔）在含rhGM-CSF（終濃度為2 ng/ml）的RPMI1640 完全培養基中誘導培養12 d獲得MDM。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態，流式細胞儀檢測細胞表面CD14 表達，鑒定MDM。將MDM 分為4 組，每組6 個復孔：①健康對照組（healthy control），健康者來源MDM；②健康+PM2.5組（healthy+PM2.5），健康者來源 MDM+PM2.5；③COPD組（COPD），COPD患者來源MDM；④COPD+PM2.5 組（COPD+PM2.5），COPD 患者來源 MDM+PM2.5。PM2.5懸液終濃度為100 mg/L。

1.2.3 qRT-PCR 檢測 TLR2 和 TLR4 mRNA 表達提取RNA，合成cDNA。TLR2 正向引物：5'-CAGGAGCTCTTAGTGACCAAGTGAA-3'，反向引物：5'-CACAAAGTATGTGGCATTGTCCAG-3'；TLR4 正 向引物：5'-AGGATGATGCCAGGATGATGTC-3'，反向引物：5'-TCAGGTCCAGGTTCTTGGTTGAG-3'；內參GAPDH 正 向 引 物 ：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，反向引物：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。擴增條件：95 ℃ 預變性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環，基因表達分析采用2-ΔΔCt法。

1.2.4 Western blot檢測TLR2和TLR4蛋白表達提取總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，取40μg 蛋白樣品行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h，加入 TLR4 一抗（1∶500）、TLR2 一抗（1∶500）及β-actin 一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜，對應IgG 二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h。化學發光試劑顯色并分析灰度值，計算相對蛋白的相對表達量。

1.2.5 激光共聚焦顯微鏡檢測吞噬功能 將蓋玻片置于24 孔板底部，使MDM 生長于蓋玻片上，洗滌，加入終濃度為0.04 mg/ml 的FITC-E. coli懸液，培養箱內孵育4 h，2%臺盼藍溶液淬滅未吞噬的FITC-E. coli，洗滌，4%多聚甲醛室溫固定30 min，Hoechst 染色液染細胞核10 min，洗滌，取出蓋玻片，封片，激光共聚焦顯微鏡檢測，FITC-E.coli呈綠色，細胞核呈藍色。采用Leica Confcal 軟件進行平均熒光強度（mean fluorescence intensity，MFI）分析，吞噬FITC-E. coli的數量越多，MFI 越高，表明吞噬能力越強。

1.3 統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行統計學分析，數據以表示，多組間比較采用單因素方差分析，相關性分析采用Pearson 相關檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MDM 鑒定 單核細胞體積小，呈圓形，細胞核居中，懸浮生長；單核細胞在rhGM-CSF 刺激下培養至第12天時，細胞體積明顯變大，貼壁生長，多數為圓形或橢圓形，少數細胞周邊可見板狀偽足或突起，胞質透明，富含顆粒（圖1A）。流式細胞術檢測單核細胞CDl4 陽性率為（93.53±8.40）%，顯著高于MDM（46.37±6.52）%，差異有統計學意義（P＜0.01），表明單核細胞被誘導成為MDM（圖1B）。

圖1 MDM鑒定Fig.1 Identification of MDM

2.2 TLR2 和 TLR4 mRNA 和 蛋 白 表 達 COPD 組MDM TLR2、TLR4 mRNA 和蛋白表達明顯高于健康對照組；PM2.5 干預后，COPD+PM2.5 組、健康+PM2.5 組上述指標分別較COPD 組、健康對照組降低（圖2）。

圖2 PM2.5對單核細胞來源巨噬細胞TLR2、TLR4表達的影響Fig.2 Effects of PM2.5 on TLR2 and TLR4 expressions in monocyte derived macrophages

2.3 吞噬能力比較 COPD組MDM吞噬FITC-E.coli的MFI明顯低于健康對照組；PM2.5干預后，COPD+PM2.5 組、健康+PM2.5 組分別較 COPD 組、健康對照組降低。健康+PM2.5 組MDM 形態不規則，吞噬的FITC-E. coli明顯少于健康對照組，細胞內可見PM2.5 顆粒，細胞核固縮，有微核現象；COPD+PM2.5 組吞噬的 FITC-E. coli明顯少于 COPD 組，細胞核致密，細胞內可見大小不一團塊聚集的PM2.5顆粒，有微核現象（圖3）。

圖3 PM2.5對單核細胞來源巨噬細胞吞噬功能的影響Fig.3 Effects of PM2.5 on phagocytosis of monocyte derived macrophages

2.4 相關性分析 健康＋PM2.5 組和COPD＋PM2.5 組 MDM TLR2、TLR4 mRNA 和蛋白表達與吞噬FITC-E.coli的MFI呈正相關（表2）。

表2 TLR2、TLR4表達與吞噬功能相關性分析（r值）Tab.2 Correlation analysis of TLR2 and TLR4 expressions and phagocytosis（r value）

3 討論

PM2.5 是空氣污染的重要組成部分，已成為危害我國居民健康的重要因素。PM2.5 與COPD 密切相關，不僅是COPD 急性加重的高危因素，也是導致COPD 發生的病因［7］。研究顯示當大氣 PM2.5 濃度＞30 μg/m3，COPD 發生與PM2.5 濃度呈直線相關［8］。PM2.5濃度每升高10 μg/m3，COPD 患者急診就診率上升5.3%，住院率升高3.1%，病死率升高2.5%［9-10］。

肺泡巨噬細胞（alveolar macrophage，AM）具有較強的吞噬活性，是呼吸道抵御PM2.5 的第一道防線，大部分顆粒物通過氣管內黏液流動和纖毛運動排出體外，進入肺內的顆粒物則主要依賴于AM 的吞噬作用。研究顯示，COPD 患者呼吸道易發生感染的原因是AM 吞噬功能降低，從而導致病原微生物定植于下呼吸道，引起COPD 反復急性加重［11］。研究還顯示，PM2.5 可抑制小鼠AM 吞噬肺炎球菌，導致肺部感染遷延不愈［12］。MIGLIACCIO 等［13］研究也發現，PM2.5 能抑制AM 對淋巴細胞的激活作用，同時減少肺組織中AM 數量，使機體抵御感染能力下降，導致呼吸道病原微生物定植。由于通過支氣管肺泡灌洗獲取COPD 患者和健康體檢者AM 較為困難，而MDM 與AM 在細胞表型及生理學功能包括吞噬功能相似，目前已成為體外研究AM 的經典細胞模型［2，6］。本研究顯示，與健康組比較，COPD患者MDM 吞噬功能低下，與 TAYLOR 等［6］研究結果一致，可能與COPD 患者下呼吸道細菌定植及慢性炎癥導致巨噬細胞長期活化而致功能耗竭有關。

TLR2、TLR4 是巨噬細胞表面重要的模式識別受體，可識別病原微生物表面高度保守的病原相關分子模式。PM2.5中含有少量微生物成分，TLR2和TLR4 是結合顆粒物的兩種主要效應受體［2］。TLR4識別革蘭氏陰性菌的脂多糖，而TLR2 識別革蘭氏陽性菌的酵母多糖和脂多肽成分。ZHAO 等［14］研究顯示，小鼠氣管內滴注PM2.5 懸液24 h 后，小鼠肺泡灌洗液中TLR2、TLR4 陽性細胞數均顯著減少。BECKER 等［15］研究也顯示 PM2.5 能顯著降低人 AM TLR4 mRNA 表達。本研究顯示 COPD 患者 MDM 基礎狀態下TLR2、TLR4 mRNA 和蛋白表達顯著高于健康組，PM2.5 能顯著抑制COPD 患者和健康者MDM TLR2、TLR4 mRNA 和蛋白表達，與上述文獻報道結果相似。

PM2.5 致巨噬細胞吞噬功能損傷的機制，目前研究發現可能與氧化損傷和細胞骨架重排有關。PM2.5 表面富含的重金屬如鐵、鋅、錳等及有機成分如多環芳烴、脂多糖等可引發肺部氧化應激，活性氧增加，抗氧化成分耗竭。活性氧導致DNA 損傷，干擾線粒體功能并啟動細胞程序性死亡，破壞細胞膜的正常結構和吞噬細胞表面的標志物，并導致肺巨噬細胞的吞噬功能下降［16］。研究還發現，PM2.5 可能會抑制肌動蛋白聚合，引起細胞骨架運動障礙，從而導致巨噬細胞吞噬能力下降［17-18］。TLR在巨噬細胞介導的固有免疫和適應性免疫中具有重要作用。一方面AM 通過細胞表面表達的TLR 識別并結合顆粒物上的病原體相關模式分子，啟動TLR 信號通路，繼而通過下游信號激活轉錄因子NF-κB 和AP-1，導致炎癥介質和趨化因子的合成增加［3］。另一方面，PM2.5可引起AM介導的免疫反應延遲或抑制，導致呼吸道細菌的易感性提高［19］。本研究顯示，PM2.5抑制MDM吞噬功能的同時也下調TLR2 和 TLR4 表達，相關分析顯示 MDM TLR2、TLR4 mRNA 和蛋白表達與吞噬FITC-E.coli的MFI呈正相關，說明巨噬細胞吞噬能力與TLR2、TLR4表達相關。

綜上所述，PM2.5 可損傷COPD 患者巨噬細胞吞噬功能，同時下調巨噬細胞TLR2、TLR4 表達；PM2.5 致巨噬細胞吞噬功能下降可能與TLR2、TLR4表達下降有關。