電化學(xué)檢測(cè)SARS-CoV-2 的無機(jī)及分析化學(xué)綜合教學(xué)實(shí)驗(yàn)

史 鎧，成 英，陳稼軒，宋九華，韓耀霞，李 艷，蒲軍禹，李玉婷，胡 育※

（1.樂山師范學(xué)院 新能源材料與化學(xué)學(xué)院，四川 樂山 614004；2.綿陽普明中學(xué)，四川 綿陽 621000）

0 引言

通過大一和大二對(duì)無機(jī)化學(xué)及分析化學(xué)課程的學(xué)習(xí)，高年級(jí)的化學(xué)專業(yè)本科生十分渴望接觸具有一定具有理論深度，實(shí)驗(yàn)難度且緊貼前沿科學(xué)研究的綜合性實(shí)驗(yàn)。因此，教師選取合適且有特色的科研成果轉(zhuǎn)化為教學(xué)綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，這對(duì)于培養(yǎng)學(xué)生綜合知識(shí)應(yīng)用的能力，鍛煉學(xué)生實(shí)驗(yàn)技能，培養(yǎng)學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度，開闊學(xué)生的學(xué)術(shù)眼界和幫助學(xué)生考研深造具有重要的意義[1-2]。

自2019 年12 月起，嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒-2（SARS-CoV-2）的爆發(fā)引發(fā)全球健康危機(jī)[3]。根據(jù)Lu 等研究者報(bào)道，SARS-CoV-2 是一種單鏈RNA 的病毒，并且它所具有的特異性RNA 序列是區(qū)分其它病原體的標(biāo)志物[4]。SARSCoV-2 具有很強(qiáng)的傳染性，其主要通過呼吸道飛沫傳播，糞—口傳播和接觸傳播（血液或含有病原體的分泌物）。目前，超過1.9 億人被診斷為SARS-CoV-2 且數(shù)百萬人死于SARS-CoV-2，嚴(yán)重危害全球公共衛(wèi)生與全球經(jīng)濟(jì)[5]。通過研究者們的不懈努力，盡管相關(guān)SARS-CoV-2 的疫苗已經(jīng)問世，但鑒于疫苗的效力有限和SARS-CoV-2的快速突變，例如奧密克戎、德爾塔、阿爾法和貝塔等。因此，實(shí)現(xiàn)早期特異性診斷SARSCoV-2 仍然是對(duì)相關(guān)疫情防控、病毒檢測(cè)和治療監(jiān)測(cè)的有效方法[6]。

2000 年，Yurk 等[7]研究者提出一個(gè)熵驅(qū)動(dòng)DNA 鏈置換的核酸診斷方法。該方法的原理是在熱力學(xué)熵驅(qū)動(dòng)下，一條DNA 鏈作為入侵序列與一條雙鏈DNA的toehold區(qū)域（5-8個(gè)堿基組成）進(jìn)行雜交反應(yīng)，然后入侵序列將雙鏈DNA 中較短的單鏈DNA 置換下來。該技術(shù)能夠在等溫且不需要任何蛋白酶的輔助條件下進(jìn)行反應(yīng)，其具有操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)迅速和低成本等優(yōu)點(diǎn)，符合綠色化學(xué)的時(shí)代要求。此外，熵驅(qū)動(dòng)DNA 鏈置換是主要依賴于堿基之間的互補(bǔ)配對(duì)，其具有很強(qiáng)的特異性。近年來，研究者們將熵驅(qū)動(dòng)DNA 鏈置換技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物檢測(cè)領(lǐng)域[8-13]。因此，基于熵驅(qū)動(dòng)DNA 鏈置換反應(yīng)，設(shè)計(jì)一個(gè)內(nèi)容新穎且綜合性強(qiáng)檢測(cè)SARS-CoV-2 靶標(biāo)核酸的實(shí)驗(yàn)主要有三個(gè)優(yōu)點(diǎn)：第一，讓學(xué)生充分了解我國對(duì)防疫SARS-CoV-2 做出的貢獻(xiàn)，強(qiáng)化思想政治教育，有利于增強(qiáng)學(xué)生的文化自信，提升民族自豪感；第二，“千里之行，始于足下”，讓學(xué)生意識(shí)到前沿科技及造福民生的科研離不開扎實(shí)的基礎(chǔ)知識(shí)；第三，可以提高學(xué)生的動(dòng)手能力，開闊學(xué)術(shù)眼界，埋下為祖國科技事業(yè)做貢獻(xiàn)的種子。

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

a）通過文獻(xiàn)調(diào)研，了解電化學(xué)傳感器的應(yīng)用及前景，掌握電化學(xué)檢測(cè)SARS-CoV-2 靶標(biāo)核酸的方法。

b）鞏固無機(jī)及分析化學(xué)相關(guān)知識(shí)，理解熵驅(qū)動(dòng)DNA 鏈置換的作用機(jī)制與電化學(xué)分析測(cè)試的原理。

c）掌握使用Origin、Photoshop 數(shù)據(jù)處理與作圖軟件。

d）了解及時(shí)有效檢測(cè)傳染病毒對(duì)遏制病毒傳播與治療的重要性。

e）培養(yǎng)學(xué)生課題設(shè)計(jì)與動(dòng)手能力，以及團(tuán)隊(duì)合作與創(chuàng)新思維。

2 實(shí)驗(yàn)原理

本實(shí)驗(yàn)原理如圖1 所示：巰基修飾的固定探針（紫色序列）與信號(hào)探針（藍(lán)色序列）經(jīng)退火形成雙鏈DNA 探針。將雙鏈DNA 探針通過Au-S 鍵固定在金電極表面，隨后采用MCH 對(duì)電極表面進(jìn)行封閉。我們?cè)O(shè)計(jì)位于固定探針3’-末端有6 個(gè)堿基組成的Toehold 區(qū)域。根據(jù)“世界衛(wèi)生組織人類COVID-19 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)臨時(shí)指南”，本實(shí)驗(yàn)選擇一條廣泛應(yīng)用研究的ORF1ab片段（長(zhǎng)為26 個(gè)堿基）作為SARS-CoV-2 靶標(biāo)序列[14]。當(dāng)不存在SARS-CoV-2 靶標(biāo)核酸時(shí)，由于大量信號(hào)探針靠近電極表面，從而獲得強(qiáng)電流信號(hào)。但是，當(dāng)加入靶標(biāo)核酸（紅色序列），在熱力學(xué)熵驅(qū)動(dòng)下，靶標(biāo)核酸與Toehold 區(qū)域結(jié)合并引發(fā)鏈置換反應(yīng)將信號(hào)探針置換下來，使得信號(hào)探針遠(yuǎn)離電極表面，導(dǎo)致電流信號(hào)減弱。因此，根據(jù)不同濃度靶標(biāo)核酸與減弱的電流信號(hào)來擬合計(jì)算，實(shí)現(xiàn)對(duì)SARS-CoV-2 靶標(biāo)核酸簡(jiǎn)單、低成本及強(qiáng)特異性電化學(xué)檢測(cè)。

圖1 基于熵驅(qū)動(dòng)DNA 鏈置換構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)SARS-CoV-2 靶標(biāo)核酸的原理圖

3 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

試劑：氯化鈉和三(羥甲基)氨基甲烷購買自國藥基團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（中國，上海）。6-巰基-1-己醇（MCH）和三（2-羧乙基）磷酸鹽（TCEP）都來自從 Sigma 公司（St.Louis,MO,USA）。SARS-CoV-2 靶標(biāo)核酸和其他核酸購自Sangon Biotech 有限公司（中國，上海），具體序列如表1 所示。所有試劑均為分析級(jí)，并使用電阻率為18.2 MΩ-cm 超純水制備所需的溶液。

表1 本綜合實(shí)驗(yàn)所用的寡核苷酸序列信息

4 實(shí)驗(yàn)方法與內(nèi)容

4.1 實(shí)驗(yàn)方法

4.1.1 電化學(xué)傳感器的制備

按照Kevin W.Plaxco 等的報(bào)道流程來進(jìn)行電化學(xué)傳感器的制備[8]。首先對(duì)直徑為3 mm 金電極進(jìn)行機(jī)械清洗（依次用0.3 和0.05 μm 氧化鋁分別打磨5 分鐘）和電化學(xué)清洗（在0.5 M H2SO4溶液中，進(jìn)行-0.3 到1.5 V 的范圍連續(xù)掃描）。最后使用去離子水進(jìn)行徹底沖洗金電極并用氮?dú)飧稍铩?/p>

在20 mM Tris-HCl 緩沖液（100 mM NaCl,pH 7.4）中的加入巰基修飾的5.0 μM 固定探針和5.2 μM 信號(hào)探針混合物加熱至95 ℃（5 min），然后通過梯度冷卻至室溫以形成兩條DNA 鏈組成的雙鏈探針。為了還原固定探針的二硫鍵，將上述雙鏈DNA 探針與1.0 mM TCEP 混合。接下來，取10 μL 上述溶液滴涂在金電極上，并在室溫下孵育2 小時(shí)后用氮?dú)獯蹈山痣姌O。最后，將上述電極浸入新鮮制備的3.0 mM MCH 中孵育1 小時(shí)來消除非特異性吸附，待清洗后用氮?dú)獯蹈桑苽浜玫膫鞲衅髁糇鱾溆谩?/p>

4.1.2 SARS-CoV-2 的檢測(cè)

在室溫下，將10 μL 含有不同濃度SARSCoV-2 靶標(biāo)核酸的Tris 緩沖液，孵育在制備好的電極上反應(yīng)90 min。隨后用緩沖溶液清洗傳感器，在CHI 660C 工作站（CH Instruments Inc，上海）上進(jìn)行電化學(xué)測(cè)量。該電化學(xué)工作站由傳統(tǒng)的三電極系統(tǒng)構(gòu)成，其中包括金電極作為工作電極，飽和甘汞作為參比電極，鉑絲作為輔助電極。最后在 Tris-HCl 緩沖液中進(jìn)行方波伏安法（SWV）測(cè)量，測(cè)試參數(shù)：掃描階躍電位為4.0 mV，掃描頻率為25 Hz，掃描振幅為25 mV 以及掃描電位為-0.4 V 至-0.1 V。

4.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

4.2.1 熵驅(qū)動(dòng)鏈置換用于電化學(xué)檢測(cè)SARS-CoV-2的可行性分析

首先結(jié)合實(shí)驗(yàn)原理，學(xué)生設(shè)計(jì)出實(shí)驗(yàn)方案并與老師討論修改。然后，學(xué)生在老師的指導(dǎo)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，記錄數(shù)據(jù)并學(xué)習(xí)使用Origin 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。最后學(xué)生通過以電位為橫坐標(biāo)，以電流強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖闡述實(shí)驗(yàn)結(jié)論。

公式中I（Non-target）為不加靶標(biāo)核酸的電流強(qiáng)度；I（Target）為不加靶標(biāo)核酸的電流強(qiáng)度。如圖2 所示，當(dāng)在沒有靶標(biāo)核酸的情況下，我們觀察到在固定了雙鏈DNA 的金電極上產(chǎn)生明顯的電流信號(hào)（藍(lán)色曲線）；當(dāng)孵育SARS-CoV-2 的靶標(biāo)核酸（濃度為100 nM）后，通過DNA 鏈置換反應(yīng)將信號(hào)探針置換下來，此時(shí)金電極產(chǎn)生的電流信號(hào)明顯減弱（紅色曲線）。該步驟主要引導(dǎo)學(xué)生學(xué)會(huì)設(shè)計(jì)對(duì)照實(shí)驗(yàn)（有無靶標(biāo)核酸）和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方案的可行性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化、傳感器的靈敏度分析以及特異性分析等步驟提供有益思路。

圖2 電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)SARS-CoV-2 的SWV 信號(hào)響應(yīng)

4.2.2 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

為了讓探索最佳的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)條件，本步驟我們采用分組的方式讓學(xué)生主要優(yōu)化了兩個(gè)實(shí)驗(yàn)參數(shù)（SARS-CoV-2 的靶標(biāo)核酸濃度為100 nM）：固定雙鏈DNA 探針的濃度和熵驅(qū)動(dòng)鏈置換反應(yīng)時(shí)間，并以變化的條件為橫坐標(biāo)，電流信號(hào)減弱百分比（△I%，公式2）為縱坐標(biāo)作圖。

首先保持熵驅(qū)動(dòng)DNA 鏈置換反應(yīng)為60 min，學(xué)生對(duì)0.2 至1.2 μM 范圍內(nèi)的最佳雙鏈探針固定濃度進(jìn)行探索。如圖3A 所示，學(xué)生探索結(jié)果為：濃度范圍為0.2-0.8μM 時(shí)，隨著固定探針濃度的增加，△I%的值也隨之增加。濃度范圍為0.8-1.2μM 時(shí)，隨著固定探針濃度的增加，△I%的值逐漸減弱。因此，當(dāng)雙鏈探針固定濃度為0.8 μM 時(shí)，我們?cè)O(shè)計(jì)的傳感器展示出最佳△I%值。接下來，固定雙鏈探針濃度為0.8 μM，學(xué)生進(jìn)一步對(duì)最佳鏈置換反應(yīng)的時(shí)間進(jìn)行探索。如圖3B 所示，△I%值隨著鏈置換反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)（30 至90 min）而增加。90 min 之后達(dá)到穩(wěn)定，表明90 min 熵驅(qū)動(dòng)DNA 鏈置換反應(yīng)達(dá)到平衡。因此，該實(shí)驗(yàn)最佳鏈置換反應(yīng)時(shí)間為90 min。

圖3 （A）雙鏈固定探針的濃度優(yōu)化和（B）鏈置換反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化

4.2.3 傳感器的靈敏度分析

在上一步最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下，本步驟我們同樣采用分組的方式讓學(xué)生考察傳感器的靈敏度。本步驟以△I%值為縱坐標(biāo)，配制一系列濃度的SARS-CoV-2 靶標(biāo)核酸溶液，靶標(biāo)核酸濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立線性方程，確定線性范圍與檢測(cè)限。如圖4A 所示，當(dāng)靶標(biāo)核酸的濃度從0 nM 增加至100 nM（曲線b 至g）時(shí)，電流強(qiáng)度隨之減弱。圖4B 展示傳感器用于靶標(biāo)核酸定量分析的校準(zhǔn)曲線。在1.0 nM 至100 nM 范圍內(nèi)，電流強(qiáng)度與靶標(biāo)核酸濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。回歸方程表示為△I%=0.5470c+6.464（c是SARS-CoV-2 的靶標(biāo)核酸的濃度），相關(guān)系數(shù)R2=0.9906。根據(jù)3σ 規(guī)則（σ 為十一次空白溶液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差），計(jì)算出傳感器的檢測(cè)限為0.32 nM。本步驟通過對(duì)比傳感器與臨床檢測(cè)SARS-CoV-2 靶標(biāo)核酸的靈敏度，引導(dǎo)學(xué)生深刻認(rèn)識(shí)靈敏度在對(duì)病毒、癌癥以及環(huán)境污染等標(biāo)志物檢測(cè)的重要意義。

圖4 （A）傳感器對(duì)不同濃度靶標(biāo)核酸的SWV 信號(hào)響應(yīng)和（B）靶標(biāo)核酸濃度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

4.2.4 傳感器的特異性分析

為了精準(zhǔn)診斷SARS-CoV-2 靶標(biāo)核酸和避免錯(cuò)誤地實(shí)驗(yàn)結(jié)果，特異性地診斷COVID-19 是構(gòu)建傳感器的另一個(gè)重大挑戰(zhàn)。為了評(píng)估我們構(gòu)建傳感器的特異性，本實(shí)驗(yàn)選擇靶標(biāo)核酸（濃度為100 nM），相同濃度地單到四堿基錯(cuò)配靶標(biāo)核酸（M1 到M4）和任意RNA 序列（miRNA-21）進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。然后學(xué)生記錄數(shù)據(jù)，并以不同的測(cè)試序列為橫坐標(biāo)，電流強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖分析實(shí)驗(yàn)結(jié)論。如圖5 所示，相比于靶標(biāo)核酸，單堿基錯(cuò)配的樣本產(chǎn)生的電流強(qiáng)度急劇上升（1.8 倍）。隨著堿基錯(cuò)配數(shù)目的增加（M1 到M4），電流強(qiáng)度也隨之升高。當(dāng)靶標(biāo)核酸序列出現(xiàn)四堿基錯(cuò)配時(shí)，傳感器的電流強(qiáng)度與任意RNA 序列樣本相似。因此，上述結(jié)果證明我們構(gòu)建的傳感器能夠強(qiáng)特異性地檢測(cè)SARS-CoV-2，這與熵驅(qū)動(dòng)鏈置換反應(yīng)的序列依賴性相關(guān)。本步驟主要引導(dǎo)學(xué)生對(duì)特異性檢測(cè)SARS-CoV-2 靶標(biāo)核酸重要性的認(rèn)識(shí)，以及理解SARS-CoV-2 突變對(duì)疫情防控帶來的干擾。

圖5 傳感器對(duì)不同核酸序列的特異性探究

4.2.5 實(shí)際樣品中SARS-CoV-2 靶標(biāo)核酸的檢測(cè)

為了進(jìn)一步評(píng)估電化學(xué)生物傳感器在復(fù)雜生物樣品中的分析性能，我們將三種不同濃度的靶標(biāo)核酸（10 nM，50 nM，100 nM）分別添加在人血清（10%）中進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2 所示，血清中的加標(biāo)核酸回收率在95.2%到105.3%之間，RSD 在3.7%到4.8%之間。上述結(jié)果表明，我們構(gòu)建的電化學(xué)生物傳感器應(yīng)用于檢測(cè)復(fù)雜的生物樣品中SARS-CoV-2 具有良好的實(shí)用潛力。

表2 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

5 教學(xué)組織實(shí)施及效果

本綜合性實(shí)驗(yàn)充分帶領(lǐng)學(xué)生回顧無機(jī)化學(xué)與分析化學(xué)課程中熵、電化學(xué)基礎(chǔ)、電位、伏安法、樣品處理等相關(guān)知識(shí)。本實(shí)驗(yàn)無需昂貴的實(shí)驗(yàn)材料和大型分析設(shè)備，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，是一項(xiàng)值得推廣的無機(jī)及分析化學(xué)綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)在于讓學(xué)生理解熵驅(qū)動(dòng)DNA 鏈置換檢測(cè)SARS-CoV-2 的原理；掌握對(duì)SARS-CoV-2 靶標(biāo)核酸的定量分析方法，以及學(xué)會(huì)對(duì)分析方法性能的評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)難點(diǎn)是如何引導(dǎo)學(xué)生設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方法的可行性，探索實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化，分析傳感器的靈敏度與特異性等，以及培養(yǎng)學(xué)生將思維及數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為圖形的能力。建議該綜合性實(shí)驗(yàn)面向化學(xué)專業(yè)本科三年級(jí)的學(xué)生開設(shè)，安排12課時(shí)，分3 次實(shí)驗(yàn)課完成，按照實(shí)驗(yàn)進(jìn)度可以靈活掌握。

a）預(yù)習(xí)內(nèi)容與要求：復(fù)習(xí)無機(jī)及分析化學(xué)知識(shí)，完成相關(guān)文獻(xiàn)調(diào)研，理解實(shí)驗(yàn)原理，設(shè)計(jì)相應(yīng)實(shí)驗(yàn)方案并與指導(dǎo)老師進(jìn)行討論。

b）第一次實(shí)驗(yàn)（4 學(xué)時(shí)）：制備電化學(xué)傳感器和完成實(shí)驗(yàn)內(nèi)容中實(shí)驗(yàn)可行性分析，同時(shí)學(xué)習(xí)使用origin 處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的方法。

c）第二次實(shí)驗(yàn)（4 學(xué)時(shí)）：完成實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化（分組完成）與標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立（分組完成）。

d）第三次實(shí)驗(yàn)（4 學(xué)時(shí)）：完成傳感器特異性分析以及血清實(shí)際樣品的測(cè)試，學(xué)習(xí)使用Photoshop 繪制實(shí)驗(yàn)原理圖。

思考與討論可設(shè)置了以下問題：

a）查閱文獻(xiàn)闡述及時(shí)有效地檢測(cè)SARSCoV-2 靶標(biāo)核酸對(duì)疫情防控和治療監(jiān)測(cè)的意義？

b）本實(shí)驗(yàn)采用最優(yōu)的雙鏈固定探針濃度是多少？為什么雙鏈固定探針濃度太低或太高都不太好？

c）在醫(yī)院，測(cè)定SARS-CoV-2 普遍采用的核酸方法是反轉(zhuǎn)錄加實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（RT-PCR）。通過文獻(xiàn)調(diào)研，你覺得本實(shí)驗(yàn)與RT-PCR 方法相比，有什么優(yōu)勢(shì)？

d）通過文獻(xiàn)調(diào)研，為什么高靈敏和強(qiáng)特異性對(duì)傳感器檢測(cè)SARS-CoV-2 靶標(biāo)核酸至關(guān)重要？

e）通過文獻(xiàn)調(diào)研，對(duì)于提高傳感器檢測(cè)SARS-CoV-2 靶標(biāo)核酸的靈敏度有什么改進(jìn)方法？

6 結(jié)論

本綜合性實(shí)驗(yàn)利用熵驅(qū)動(dòng)鏈置換反應(yīng)，導(dǎo)致電流信號(hào)強(qiáng)度變化與SARS-CoV-2 靶標(biāo)核酸濃度的關(guān)系，設(shè)計(jì)了一個(gè)SARS-CoV-2 檢測(cè)的無機(jī)及分析化學(xué)綜合教學(xué)實(shí)驗(yàn)。從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，該實(shí)驗(yàn)的構(gòu)建的電化學(xué)生物傳感器可以實(shí)現(xiàn)低成本、特異性及簡(jiǎn)單地檢測(cè)SARS-CoV-2。此外，本實(shí)驗(yàn)兼顧實(shí)驗(yàn)的綜合性與設(shè)計(jì)性，可以讓學(xué)生運(yùn)用熵、電化學(xué)基礎(chǔ)、電位、伏安法等相關(guān)理論知識(shí)和掌握相關(guān)實(shí)驗(yàn)技能的同時(shí)，培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)態(tài)度，開闊學(xué)術(shù)眼界，使學(xué)生掌握系統(tǒng)的科學(xué)研究方法，提升他們的綜合素質(zhì)。