小麥銘賢169休眠解除期間種子結構與主要成分的變化

張明婷，姚雅鑫，王京宏，孫風麗，張 超，奚亞軍

(1.西北農林科技大學農學院，陜西楊凌 712100；2.農業農村部西北地區小麥生物學與遺傳育種重點實驗室，陜西楊凌 7102100；3.陜西省雜交油菜研究中心, 陜西楊陵 712100)

小麥(L.)是全世界廣泛栽種的一種作物，也是歷史上第一個被馴化的主食作物。中國是世界上較早種植小麥的國家之一，而黃淮麥區是我國小麥種植面積最大的地區之一，栽培面積占全國小麥總面積的40%，育成和推廣的品種數量較多。銘賢169是在黃淮麥區育種試驗中廣泛使用的條銹病誘發材料，其種子具有休眠特性。休眠的種子可以抵擋不良環境的影響，即使長期貯藏仍能保持較高生活力。植物種子通過自身休眠可以避開外界不利因素，對保持其自身的繁衍具有重要意義。然而在馴化小麥的歷史中，為了追求更好的經濟效益和快速均勻的發芽，休眠特性被人為弱化，導致現在生產上的骨干品種大多不具有休眠性，加劇了穗發芽現象的發生，穗發芽會導致籽粒品質劣化，食用和種用安全性降低。解決穗發芽問題最經濟有效的途徑是培育具有強休眠性的品種。

種子的休眠性主要與基因型有關，也受植物激素、光照、溫度、營養物質和后熟作用等外界因素的影響。干燥后熟通常是解除新鮮收獲的成熟小麥種子休眠的常用方法。小麥種子的后熟期一般為一至兩個月左右，后熟初期的種子呼吸強度、耐儲藏性、酶活性、生理代謝、品質和發芽率等都會隨著后熟時間的延長而發生變化。孫果忠等的研究表明，隨著后熟時間的延長，冀麥1號、西農6028等9個小麥品種的種子萌發力提高的程度不同。馮攀屹等研究表明，后熟對小麥中的碳水化合物、含氮化合物、脂類等有很大影響。后熟過程中，小麥發芽率、淀粉、糖類、蛋白質、酶類以及mRNA等均會發生變化。通過轉錄組分析發現，細胞壁修飾相關程序在種子后熟過程中被激活，激素的轉錄和淀粉、蔗糖代謝等途徑在小麥銘賢169種子休眠至萌發的過渡中顯著上調表達。研究表明，后熟誘導小麥種子打破休眠與細胞信號轉導和能量代謝相關蛋白質的差異表達有關，如編碼α-淀粉酶和淀粉合酶的基因的表達發生了顯著變化。但是，有關休眠解除期間小麥種子結構和主要成分變化的報道甚少。

本研究以休眠性明顯的銘賢169為試材，探究其種子在發育和后熟階段的休眠解除過程中淀粉和種皮顯微結構以及主要成分的變化，以期為揭示小麥穗發芽抗性機制提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試材料及種植條件

本試驗所用材料銘賢169，2019-2020年度種植于陜西楊凌西北農林科技大學北校區試驗田(34°17′24.5″N，108°04′05.2″E)，生長條件同當地大田。成熟時取移除穗上端和下端的種子，取穗子中部的種子脫粒、晾曬后在室溫下儲存備用。

1.2 種子和胚的發芽率測定

在小麥花后10、20、30、40 d分別取穗中部種子500粒，收獲后后熟15、30、45、60、75、90 d種子分別取500粒，用于發芽率測定。

種子發芽率測定：取花后或后熟不同時間種子250粒，用5%次氯酸鈉進行表面消毒15 min，用無菌水沖洗5次；在直徑為9 cm的無菌培養皿中放雙層無菌濾紙并加入8 mL的無菌水，將滅菌種子腹溝朝下放置于培養皿，每皿50個種子。在培養箱中進行發芽，發芽溫度設置為20/15 ℃(光照/黑暗)，光周期為10/14 h(光照/黑暗)。每12 h記錄發芽種子數，直到7 d后發芽率不再發生變化(胚根突破種子外皮>1 cm即為發芽)。

胚發芽率測定：參考孫果忠等的方法稍作改動，取開花后或后熟不同時間種子各250粒，用5%次氯酸鈉消毒3 min(后熟種子需浸泡4～6 h)，再用ddHO沖洗5次；無菌操作下剝離胚，將胚盾片朝下擺放在配制好的MS培養基上，每皿放胚50粒，用parafilm封口，放于培養箱中 20 ℃暗培養。每12 h記錄發芽數，直到發芽率不再發生變化，以根尖變白膨大(直徑>1 mm)為發芽。

1.3 種子吸水率和活力測定

吸水率的測定：隨機選取50粒收獲備用種子，稱重后置于燒杯中，加入ddHO在室溫下浸種。每隔6 h取出種子，用濾紙吸干表面水分后稱重，直至連續兩次種子質量恒定。

種子活力(TTC)檢測參考高俊鳳方法。5次重復。

1.4 種皮結構和淀粉粒的顯微結構觀察

每20 d取收獲備用種子5粒，共取6次，用解剖刀切成2 mm厚的橫切片，挑選切面平整的樣品用雙面導電膠粘貼于掃描電鏡樣品臺上，橫斷面朝上，吹去表面的灰塵后，用真空噴涂儀對樣品進行噴金，并在S-3400N型電子顯微鏡(加速電壓5～15 KV)下觀察特定部位并拍照。

1.5 籽粒品質測定

采用perten公司的DA7200近紅外古物分析儀測定樣品水分、吸水率、粗蛋白、面筋和淀粉含量、沉降值，重復5次。

1.6 面粉RVA粘度參數測定

參考Jiang的方法略做改動，準確稱取含水量為12%的銘賢169面粉3.0 g置于小鋁罐中，加入蒸餾水25 g；用快速粘度分析儀(RVA 4500, Perten, SWISS)測定黏度相關指標。程序設置為在50 ℃保持1 min，以12 ℃·min的速率升溫至95 ℃，保持2.5 min，以同樣的速率降溫至50 ℃，保持2 min；前10 s以960 r·min的速率進行攪拌，之后以160 r·min速率攪拌。重復3次。

1.7 淀粉熱穩定性測定

淀粉提取參考peng等的方法并作修改。取5 g銘賢169籽粒在0.5 mol·L的NaCl溶液中浸泡16 h，在研缽中研成勻漿并用500目的尼龍網過濾，直至濾出液用碘染色不變藍為止。將淀粉勻漿在6 000 r·min下離心5 min，去上清，沉淀依次分別用2 mol·L的NaCl、2% SDS和0.2%的NaOH溶液洗滌，直到沉淀變為白色為止；用丙酮清洗3次，風干后過篩。于-20 ℃貯存備用。每個樣品重復2次。

取10 mg淀粉于坩堝中，放入熱穩定分析儀中(EXSTAR TG/DTA 6000日本)，在氮氣氛圍下以10 ℃·min的升溫速率從30 ℃升至 550 ℃，得到熱重-熱重微分(TG-DTG)和差熱(DTA)譜圖。每個樣品重復3次。

1.8 淀粉粒徑測定

淀粉提取同1.7方法，粒徑采用MASTERSIZER-2000激光粒度儀(Malvern UK公司)測定。稱取0.5 g銘賢169淀粉懸浮于5 mL蒸餾水中；超聲波分散20 s，統計的總粒數達到10 000時停止。數據用激光衍射法進行自動分析。每個樣品重復3次。

1.9 淀粉酶活性和可溶性糖含量的測定

淀粉酶活性和可溶性糖的測定參照高俊鳳方法。重復3次。

1.10 數據處理

用SPSS進行數據分析，用Excel作圖。

2 結果與分析

2.1 銘賢169種子發芽率變化

從圖1A可以發現，收獲前的胚在花后25 d已經具有發芽能力，開花后35 d胚發芽率增加，胚伸長率增加，胚兩端都有明顯的芽伸出。而種子在花后35 d沒有發芽。開花后40 d，胚發芽率超過40%，種子發芽率只有3%(圖1B)。說明在收獲前，種子休眠不是由胚引起的，推測胚以外的結構對種子休眠有著正向的作用。收獲后的種胚和種子萌發率都隨后熟時間延長而升高。在收獲后15 d，胚發芽率達到80%，在收獲后90 d達到100%(圖1C)。在收獲后15～30 d，種子發芽率從3%快速增長到40%，在收獲30 d天后增長率變慢。以上結果說明，種胚萌發能力始終強于種子的萌發能力；銘賢169的休眠由胚以外的母體成分引起，其可能的原因是胚之外的某些母體成分抑制了胚向外延伸，也可能是胚乳和種皮的機械結構阻礙了胚芽的伸長。

A：開花后25 d、35 d種胚和種子發芽情況(上排：種胚發芽；下排：種子發芽)。B：發育期種胚和種子萌發率。C：后熟期種胚和種子萌發率。

2.2 銘賢169種子吸水率和活力變化

圖2結果表明，在后熟期間，干燥的銘賢169種子吸水的初始階段(0～12 h)吸水速率最快，此后吸水速率逐漸變慢，48 h后吸水率不再發生變化。S5的吸水率最高，48 h的吸水率達到66%，S1的吸水率最低，為61%(圖2A)。結果說明，吸水率隨著后熟時間的延長而逐漸升高，與發芽率趨勢相同。種子活力隨后熟時間延長整體呈上升的趨勢，從后熟初期的80%增加到100%(圖2B)，在S3時期種子活力明顯下降，可能是后熟期高溫潮濕的環境抑制了部分種子的活性，但與后熟發芽率的相關分析表明，種子活力與發芽率關系不大。

S1～S5分別表示后熟20、40、60、80、100 d。下同。

2.3 銘賢169種皮結構和淀粉粒顯微結構變化

銘賢169種子的淀粉粒呈圓盤或透鏡狀，以飽滿的A型淀粉粒為主，周圍分布著呈球形的B型淀粉粒。S1時期，A型淀粉粒形狀飽滿，表面光滑無褶皺無破損，有少量B型淀粉粒分布在周圍，且各淀粉粒之間的界限分明(圖3)。S2和S3時期，A型淀粉粒表面不光滑，有凸起和小孔出現，偶有破損殘缺的淀粉粒，并且形狀也不夠飽滿，略為凹陷和扁平；A型淀粉數量較多，界限比較清晰，周圍偶有出現蛋白基質的結構。S4時期，A型淀粉粒表面出現明顯的斑點凹陷，類似月球坑的形狀，淀粉粒之間的空隙縮小，連接變得緊密；A型淀粉粒數量變少，B型淀粉粒增多，且A型淀粉粒被大量蛋白基質包圍。S5時期，淀粉粒破損情況加劇，幾乎沒有表面完整光滑的A型淀粉粒，且數量減少；B型淀粉粒表面也有破損現象，并且粘連現象嚴重。S6時期，A型淀粉粒的破損程度加劇，數量少；大部分結構嵌入B型淀粉粒和蛋白基質之中，形成團狀結構，A型淀粉粒的界限模糊已經無法與其他物質分離。

圖3 休眠解除期間銘賢169淀粉粒的顯微結構

銘賢169小麥種皮中，表皮細胞呈條形，細胞中間凹四周高，表面十分不光滑，有褶皺，細胞與細胞間以明顯的條狀突起隔開，表面分布著灰塵或蛋白基質的碎片(圖4)。S1時期，表皮細胞紋路緊湊清晰，排列得很有規律，其中間隔的起伏較強。后期的表皮紋路不如S1時期清晰，排列逐漸分散，不平整，以S5和S6時期這種變化更為明顯。S5時期的細胞間隔模糊，褶皺模糊不清晰，寬窄不一致，整體看上去種子表面起伏較大；S6時期褶皺不明顯，細胞排列分散無規律。結果表明，隨著后熟時間的延長，種子表面細胞從排列緊密到疏松無規律，其可能導致更多的空氣和水分進入種子內部從而解除休眠。

圖4 休眠解除期間銘賢169種皮表面的顯微結構

從圖5可以看出，種籽實皮由多層細胞組成，在S1和S2時期，每層組織排列緊密，中間的縫隙較小。S3-S6時期，隨著后熟時間的延長，每層細胞之間的距離增加，排列變得疏松，厚度增加。S1時期，胚乳外部的柵欄細胞形態明顯，細胞成規則的四邊形，表面光滑，且排列緊密，與胚乳結合緊密，胚乳細胞的表面光滑完整。S2時期，柵欄細胞開始變形，出現橢圓形細胞，排列疏松。S3和S4時期，柵欄細胞表面粗糙，細胞周圍出現明顯的斷裂結構，與下層胚乳的結合不如S1時期緊密，胚乳細胞的表面破損，露出內部的淀粉粒。S5時期，柵欄細胞的表面不完整，形狀接近圓形；S6時期，柵欄細胞變為扁平的四邊形，與種皮和胚乳之間出現明顯縫隙，分層明顯。

圖5 休眠解除期間銘賢169種皮橫斷面的顯微結構

2.4 銘賢169籽粒品質變化

銘賢169種子水分含量和吸水率隨著儲藏時間的延長而顯著增加，對比S1時期和S5時期，二者水分含量和吸水率差異均顯著。后熟初期，淀粉含量的變化不明顯，在S4和S5時期，淀粉含量顯著增加，增幅接近2%。推測S1～S3時期淀粉含量也在增加，由于淀粉含量基數較大，所以表現不明顯，直到后熟末期，淀粉累加使得淀粉含量的上升變得明顯。沉降值在后熟期間的變化可分為三個階段，第一階段沉降值快速降低，從44 mL快速下降到41 mL；在第二階段(S2～S4時期)沉降值保持穩定，約為41.5 mL；第三階段是后熟末期，沉降值顯著下降(接近2 mL)。推測銘賢169的蛋白質可能在后熟初期和末期發生變化，導致沉降值改變。濕面筋含量和粗蛋白含量在后熟期內整體變化不大。

圖6 休眠解除期間籽粒品質變化

2.5 銘賢169種子淀粉糊化特性變化

隨著后熟時間的延長，銘賢169的各被測糊化指標均呈上升的趨勢，峰值粘度、破損值、終粘度和回生值各后熟時期間差異不顯著；S5時期的谷值粘度值顯著高于S1時期(圖7A)。峰值時間變化顯著，S1時期顯著低于S5時期(圖7B)。糊化溫度呈下降趨勢，但差異均未達到顯著水平(圖7C)。整體來看，后熟期間銘賢169糊化特性并未發生明顯的變化。

圖7 后熟期間糊化特性的變化

2.6 休眠解除期間銘賢169淀粉熱特性變化

銘賢169的淀粉有三個明顯的吸熱階段(圖8A)：第一階段為<140 ℃，對應的DTA曲線為吸熱峰，推測主要由水分蒸發引起；各后熟時期種子的吸熱反應溫度大致相同，S1吸收的能量最多，S3最少；第二階段(250～330 ℃)對應的DTA曲線為吸熱峰，S3～S5吸熱峰發生溫度大致在300 ℃，而S1和S2的吸熱峰出現在溫度為 275 ℃，其中S5吸收的熱量最多，S2最少，可能是由C-CH、C-O和C-C鍵發生斷裂而引起的；第三階段為溫度>330 ℃，吸熱峰的出現溫度有較大差異，吸熱峰溫度最低的是S2，最高的是S5，而反應所吸收的能量是S5最多，S2最少。在S1和S2的差熱曲線中，220～250 ℃出現了一個小的放熱峰，而其他時期并沒有這一階段的放熱(圖8A)。推測在小麥后熟期間，初期和末期的淀粉性質可能發生一些變化。差熱分析表明，銘賢169在后熟期內淀粉的熱穩定性增強，初期階段的熱量變化與末期階段有所不同。

由TG曲線分析可知，淀粉降解分為兩個階段(圖8B)。第一階段發生在30～120 ℃，由于水分的蒸發而出現小幅度的失重，各后熟時期淀粉的失重速率相近。第二階段的降解溫度為220～350 ℃，淀粉顆粒迅速失重，形成明顯失重臺階，各時期的下降拐點不相同。S1發生失重的溫度最低，大約為215 ℃，S3溫度達到250 ℃左右才開始分解失重。S1和S2的第二階段曲線的拐點比較接近，而S3～S5的拐點形狀相似，說明后熟前后的性質不同。350 ℃后重量緩慢下降，直到550 ℃反應結束時，S1的剩余質量最大，而S5最小(圖8B)。從DTG的試驗結果可以看出，銘賢169淀粉的失重分為兩步，與TG曲線對應。在失重第一階段，S2的峰值是最低的，峰面積也最小，說明失重速率最慢，失重量最小，熱穩定性較差。S5的峰值最高(圖8C)，失重速率最快，失重最大，熱穩定性較強。第二階段失重的差異明顯，S1峰值峰面積最小，而S5最大。表明在淀粉迅速分解的階段，S1分解溫度最低，分解速率最慢；S5分解溫度最高，速率最快(圖8D)。這些結果說明后熟作用可增加淀粉熱穩定性。

圖8 休眠解除期間淀粉熱差熱重變化

2.7 休眠解除時期銘賢169淀粉粒徑變化

隨著后熟時間的延長，淀粉粒徑分布有所差異(表1)。

表1 淀粉粒徑分布

從數量百分比而言，各后熟時期淀粉的D10值在2.106 7(S4)～2.126 7(S2)μm之間，隨著后熟時間延長，粒徑逐漸減小(除S5時期)，各時期差異不顯著。D50中粒徑的分布差異不大，散布在2.706 7(S4)～2.790 0(S2)μm之間。D90粒徑分布在19.886 7～23.260 0 μm之間，S1和S2與S3～S5之間差異顯著，說明淀粉的大粒徑隨著后熟時間的增加而減小。

體積百分數，D10在S5與S3和S4之間出現顯著差異；S5的D50粒徑值幾乎為其他時期的2倍，差異顯著；D90的粒徑分布范圍為71.283 3～168.870 0，最大值是S5時期。總體來看，粒徑體積百分數逐漸減小，但S5時期增大明顯，具體的原因還有待探討。

2.8 休眠解除期間銘賢169種子的可溶性糖含量、淀粉酶活性變化

可溶性糖在銘賢169后熟過程的變化如圖9 A。S1時期，銘賢169小麥可溶性糖含量較高，到S2時期明顯下降，隨后進入一個穩定的時間段(S2～S4)，S4～S5期間快速下降。α淀粉酶和β淀粉酶活性隨后熟時間延長逐漸下降，但β淀粉酶活性始終高于α淀粉酶，均以S1時期的活性最高。表明后熟作用會降低種子可溶性糖含量，減弱淀粉酶活性。

圖9 休眠解除期間淀粉可溶性糖含量(A)和淀粉酶活性(B)

3 討 論

目前，有關小麥休眠機制還沒有統一的定論，之前的研究普遍認為，母本的種皮和胚乳對子代的休眠有著重要作用。毛伯仁和吳兆蘇將不同休眠期的品種進行正反雜交，結果表明，子一代的休眠性傾向母本。本研究比較銘賢169籽粒建成時期和收獲后種胚和種子的休眠解除過程，發現灌漿期種胚在花后25 d即具有發芽能力，花后35 d胚萌發率可達35%，但完整種子仍處于休眠狀態。推測銘賢169的休眠性受胚乳和種皮等母體結構的影響。早期研究指出，麥類作物的種皮是制約種子萌發的重要因素，本研究結果也表明，離體胚的萌發率更高，而具有完整胚種皮的籽粒休眠性更強。可能的原因是母體通過進化出一些機制來控制種子的休眠行為，如母本硬化的外包組織(種皮)和大量的胚乳等成分。說明種皮和胚乳對小麥種子休眠和萌發具有一定的 影響。

種皮是小麥籽粒吸水和透氣的最大障礙，也是母株組織控制休眠的重要機制。本研究分析了自然條件下后熟的銘賢169種皮顯微結構的變化，發現后熟作用會導致表皮細胞排列疏松無規律，組織結構變薄，增加種皮吸水率。這與蔣國梁等的研究一致，籽粒吸水速率與穗發芽呈顯著正相關，吸水速率快的品種穗發芽嚴重，反之則輕。所以種皮結構變化導致吸水速率變化可能是穗發芽的原因之一。本研究表明，剛成熟時期的銘賢169由于種皮結構吸水性不強，因此具有較強的穗發芽抗性，種皮細胞壁的纖維含量和厚度會影響水分的吸收，后熟期間的銘賢169籽粒種皮可能因干燥變得結構疏松，不僅提高了水分的透性，更重要的是有利于氧氣的供應和弱化了機械物理阻礙，從而利于發芽。

淀粉是小麥籽粒內含量最多的儲藏性碳水化合物，約占總量的70%，主要由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成。本研究發現，后熟作用使銘賢169種子B型淀粉粒的比例增加，A型淀粉粒破損嚴重且與蛋白質結合緊密。王 增等的研究結果表明，弱休眠性的小麥淀粉粒分解程度更大，淀粉粒與蛋白基質緊密包裹；而強休眠性的種子內部淀粉粒分解程度較輕，與蛋白基質結合松散。這與本研究結果相同，推測銘賢169小麥種子休眠性與淀粉粒的分解程度和與蛋白質結合方式有關。此外，本研究表明，在后熟期間銘賢169的大淀粉粒徑減小(表1)，淀粉的失重量減小，熱穩定性增強，后熟期間總淀粉含量逐漸增加。這些結果與徐 瑞等，吳俊男等的研究一致，暗示在后熟期間淀粉性質的變化在銘賢169休眠解除機制方面發揮重要作用。

小麥籽粒中蛋白質含量約占12%～14%。在本研究中，由醇溶蛋白和麥谷蛋白組成的面筋含量在后熟期間上下波動，未出現明顯變化，說明后熟作用對銘賢169的蛋白質含量的影響不大。有研究表明，新收獲小麥在室溫條件儲存，總蛋白含量基本不變，但蛋白質中各組分會發生變化，部分蛋白質在蛋白酶的水解下變成小分子肽類和氨基酸，同時形成新的氨基酸和蛋白質。推測銘賢169蛋白質含量的波動可能是由于內部組分的變化導致的。

在本研究中，可溶性糖含量在后熟初期劇烈下降，中期平穩后又顯著下降，這與徐 瑞的研究結果一致。其原因可能是，小麥在后熟初期還未達到生理成熟，籽粒內部進行著復雜的分解合成作用，導致可溶性糖大量消耗。經過一段時間的穩定后，可溶性糖含量又因為淀粉的合成而逐漸減少。說明銘賢169后熟期間休眠解除與淀粉和可溶性糖含量密切相關。酶活性也是影響小麥后熟期間碳水化合物含量變化的重要因素，其中最主要的是淀粉酶。胚乳中的淀粉需要在淀粉酶的作用下轉化為糖，然后運往種胚的生長部位，為構建組織提供底物和能量。本研究結果表明，淀粉酶活性在小麥收獲初期較高，在后熟期間逐漸下降。這與孫 輝等和王曉曦等研究結果一致，說明后熟作用降低銘賢169淀粉酶活性是導致休眠解除的重要原因。