生物質炭對連作參地土壤肥力及微生物特性的影響

楊 莉 勾 穎 文子偉 劉宇航 潘根興 楊利民,*

(1 吉林農業大學省部共建生態恢復與生態系統管理國家重點實驗室培育基地，吉林 長春 130118；2 南京農業大學農業資源與生態環境研究所，江蘇 南京 210014)

人參主產于我國東北林區，是我國根類藥材中最具代表性的忌連作植物，其忌連作年限長達10～30年[1]。目前人參嚴重的忌連作現象與道地產區宜參土地資源的不斷減少已成為影響人參產業發展、保障市場供給的重要阻礙。針對以上問題的解決辦法已在業界達成共識，即提升老參地再利用率[1]。栽培過人參的土地稱為老參地，與未栽種過人參的土壤相比，老參地土壤的比重、容重更大，總孔隙度更小，隨著栽參年限的延長，土壤會出現板結，通氣、透水性能下降，養分含量降低，微生物群落失調等問題[2-3]。連作人參則會出現根系活力、抗病能力降低，燒須、爛根、土傳病害高發等癥狀，進而大面積減產甚至絕收[4]。為縮短老參地忌連作年限，學者們開展了廣泛的嘗試，如施用生物有機肥、生物菌劑、土壤滅菌等[5-6]，結果發現老參地問題與人參-根際土壤微生態系統內諸多因素密切相關，單一的方法或技術并不能解決所有問題[7-8]，參地土壤的修復、改良還需要不斷探索新方法、耦合新技術，并且新技術的突破重點應在于平衡老參地土壤養分供給及改善微生物群落結構等方面[4, 9]。

生物質炭是一種新型土壤改良劑。目前已積累了較多應用生物質炭改良大田作物土壤的成功經驗，研究認為這與生物質炭具有良好的土壤環境修復與調節作用有關[10-12]，如降低土壤酸度與有害物質活度、提高土壤團聚性、增加田間持水量、減少養分淋失等[13]。生物質炭疏松多孔的結構還可為根際有益微生物提供良好的生存環境，有利于恢復并重建健康根際生態系統[14]，從而實現農業生產的良性循環。綜合上述分析，生物質炭的優勢與老參地土壤修復需求高度吻合，但目前有關應用生物質炭改良、修復老參地土壤的相關研究鮮有報道。因此，本試驗研究3種原料的生物質炭(玉米秸稈炭、稻殼炭和椰殼炭)對老參地土壤肥力及微生物群落的影響，探討生物質炭對老參地土壤的修復效果，旨在為生物質炭在人參栽培土壤中的開發應用，以及逐步構建老參地土壤原位修復、養護技術提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

老參地土壤改良試驗地設置在吉林省白山市灣溝鎮平川村(海拔719 m；126°23′～127°11′E，41°48′～42°13′N), 土壤前茬植物為人參(三年生)。起參后翻耕2～3次，深度30～40 cm，每次間隔7～10 d，翻耕過程中將遺漏的參根、雜草等清除，最后一次翻耕時施入枯草芽孢桿菌(100億CFU·g-1，美國拜沃股份有限公司)，施入量100 g·667m-2。試驗地土壤基本性質如下：有機質含量38.45 g·kg-1、堿解氮83.24 mg·kg-1、有效磷34.79 mg·kg-1、速效鉀160.03 mg·kg-1、pH值5.06、土壤電導率(soil electric conductivity, EC)48.35 μs·cm-1。

試驗于2017—2019年在平川村老參地進行，共設置5個處理，分別為老參地(CK)、老參地+玉米秸稈炭(YMT)、老參地+稻殼炭(DKT)、老參地+椰子殼炭(YKT)和新林土處理(來源于參地周圍未開發種植過的林區)。具體施入方法：將3種生物質炭(購自南京三聚生物質新材料科技有限公司，基本性質見表1)按15 kg·10m-2施用量施入土壤中，小區面積為10 m2，每處理3次重復，深翻混勻后以不添加生物質炭的老參地為對照(CK)。自然放置一個冬季，于翌年5月起壟，播種人參種子，主要的田間管理為每年進行3～5次松土，清除雜草，培土扶苗。于2019年9月取出部分人參及土壤樣品，測定兩年生人參根長、根重、皂苷含量及土壤理化性質等指標。

表1 3種生物質炭的基本性質Table 1 Basic properties of 3 kinds of biochar

1.2 測定項目與方法

1.2.1 人參皂苷含量測定 人參樣品取回后用流水洗凈，濾紙吸干水分后采用游標卡尺量取根長。然后將樣品放于烘箱中低溫烘干至恒重，精密稱定人參樣品根干重后粉碎過篩并保存。采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)測定11種人參單體皂苷含量?？傇碥蘸繛楦鲉误w皂苷含量之和，具體測定方法參考文獻[15]。

1.2.2 土壤理化性質 土壤pH值采用雷磁pHS-3c型pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司)測定，土水比為1∶5(v/w)；土壤有機碳含量采用重鉻酸鉀法測定；速效鉀含量采用乙酸銨浸提原子吸收法測定；堿解氮含量采用培養皿擴散法測定；有效磷含量采用鹽酸硫酸浸提法測定。具體步驟參見《土壤農化分析》[16]。

1.2.3 土壤微生物功能多樣性 采用Biolog-Eco微平板法，每孔的平均顏色變化率(average well color development,AWCD)=∑(Ci-Ri)/n。其中，Ci為ECO板每個孔對應的吸光度值，Ri為對照,n=31(培養的孔數)。

1.2.4 土壤微生物結構多樣性 采用E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit試劑盒(美國，Omega)提取細菌總DNA， Qubit3.0 DNA檢測試劑盒(馬來西亞，Thermofisher)精確定量DNA濃度，瓊脂糖凝膠檢測DNA完整性。

PCR擴增及DNA純化回收：引物為融合了MiSeq測序平臺的V3-V4通用引物[341F引物：C C C T A C A C G A C G C T C T T C C G A T C TG (barcode) C C T A C G G G N G G C W G C AG；805R引物：G A C T G G A G T T C C T T G G C A C C C G A G A A T T C C A G A C T A C H V G G G T A T C T A A T CC]。擴增條件：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，45℃退火20 s，65℃延伸30 s，5個循環；94℃延伸20 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，20個循環。PCR擴增結束后，將純化質檢合格的擴增產物1∶1(w/w)等量混合，利用MiSeq臺式測序儀(美國Illumina公司)進行雙端測序。

16SrRNA V3-V4區高通量測序：由上海生工生物工程技術服務有限公司完成，對于MiSeq雙端測序數據，首先根據PE reads之間overlap的關系，利用PEAR軟件將成對reads拼接成一條序列，采用cutadapt軟件去除原始序列3′端測序接頭后根據barcode區分樣本序列，并利用Prinseq軟件對各樣本序列進行質控和過濾，得到各樣本數據。

1.3 數據統計與分析

采用Microsoft Office 2016、SPSS 22.0軟件對相關數據進行統計分析，Duncan 多重比較法進行差異顯著性分析，P<0.05表示具有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 生物質炭對連作人參產量與質量的影響

由表2可知，生物質炭處理后兩年生人參根重、根長顯著高于老參地處理，分別平均增加了384.91%和65.56%，對根重、根長促進效果最佳的處理分別為玉米秸稈炭、椰殼炭。人參皂苷PPD(protopanaxadiol)、PPT(protopanaxatriol)分別為11種單體皂苷中二醇型與三醇型皂苷之和，3種單體皂苷Rg1、Re、Rb1為《中國藥典》[17]規定指標，在皂苷類物質中占比較高。分析生物質炭處理后人參樣品皂苷含量差異可見，其人參總皂苷、PPD和PPT含量均高于老參地處理，平均上升了0.09、0.08、0.03個百分點。單體皂苷中除Rg1外，Re、Rb1含量表現為部分生物質炭處理低于老參地。綜上，生物質炭有利于重茬參苗產量與品質的提升，對產量的促進作用大于品質。

表2 連作人參種苗質量分析Table 2 Quality analysis of ginseng seedlings

2.2 生物質炭對連作參地土壤肥力的影響

由表3可知，增施生物質炭后，土壤堿解氮、速效鉀、pH值、陽離子交換量(cation exchange capacity, CEC)存在一定波動，但土壤有效磷和有機碳含量均表現出增加趨勢，增幅分別為47.04%～237.73%、8.09%～38.71%，表明添加生物質炭有助于提升老參地土壤有效磷、有機碳含量。對比3種炭材料的改善效果發現，玉米秸稈炭、稻殼炭、椰殼炭處理下分別有4、5、3項土壤肥力指標高于老參地處理，平均增幅分別為17.29%、47.66%、97.07%?？傮w看來，施用稻殼炭對老參地土壤的改良作用優于其他2種生物質炭材料。

2.3 連作老參地土壤微生物代謝活性及碳源利用特征分析

采用Biolog-Eco平板法分析各處理下土壤微生物代謝活性，結果如圖1所示。各樣品AWCD值變化均呈“S”型，24 h內顏色變化不明顯，24～48 h后進入對數生長期，168 h后生長趨勢減緩。4個處理中，老參地AWCD值始終低于各生物質炭處理，以玉米秸稈炭、稻殼炭處理AWCD值最高，表明生物質炭處理后土壤微生物對底物碳源的利用能力增強。總體看來，144～168 h時微生物生長進入穩定期，且各處理間存在一定差異，因此選用168 h處AWCD值進行分析。

表3 生物質炭處理對老參地土壤肥力的影響Table 3 Effect of biochar treatment on physical and chemical properties of replanted soil of ginseng

圖1 各處理下土壤微生物群落AWCD值變化Fig.1 Variation in AWCD of soil microbial community in different treatments

Biolog-Eco平板上含31種碳源，可分為6類。不同處理下土壤微生物對該6類碳源的利用情況如圖2所示。老參地土壤微生物偏好碳源排序為聚合物類、羧酸類、氨基酸類、碳水化合物類，經生物質炭處理后土壤微生物表現為對聚合物類、酚酸類、氨基酸類、羧酸類碳源利用效率較高，其中稻殼炭處理下上述4類碳源利用率分別增加了336.99%、499.64%、330.41%、208.27%；玉米秸稈炭、椰殼炭處理下分別增加了287.30%、676.39%、295.76%、229.22%，60.39%、136.02%、125.42%、57.36%。稻殼炭與玉米秸稈炭處理后大部分碳源利用率與老參地差異顯著，表明生物質炭處理后土壤微生物碳源利用能力增強且偏好碳源有所改變，以酚酸類物質為底物的功能微生物種群數量得到了提升。

圖2 不同處理下土壤微生物碳源利用特征Fig.2 Characteristics of soil microbial carbon source utilization under different treatments

2.4 連作參地土壤微生物碳代謝的主成分分析

基于土壤微生物對31種碳源利用程度的差異，對不同土壤處理進行主成分分析，結果發現不同生物質炭處理后老參地土壤微生物群落功能差異明顯(圖3)，PC1和PC2累計貢獻率為86.61%，可解釋大部分變異，椰殼炭與老參地分別落在第二、第三象限，二者因子得分距離較小，表明二者碳源的利用情況相似度較高，玉米秸稈炭和稻殼炭分別落在第一、第四象限，與老參地差異較大。3種生物質炭中，椰殼炭處理受PC1上主要碳源影響較大，稻殼炭受PC2上碳源影響較大，玉米秸稈炭同時受PC1和PC2上碳源影響。

圖3 生物質炭處理下土壤微生物碳代謝主成分分析Fig.3 Principal component analysis of carbon source metabolism pattern under different treatments

分析PC1、PC2上的優勢碳源，結果如表4所示。以|r|>0.8計，31種碳源中共有13種對PC1貢獻較大，分別是碳水化合物5種、氨基酸3種、羧酸2種、聚合物2種、酚酸1種；對PC2貢獻較大的碳源共有5種，包括聚合物2種，碳水化合物、氨基酸、羧酸各1種。綜合分析，碳水類、氨基酸類及聚合物類為不同生物質炭處理下對土壤微生物群落代謝特征起分異作用的主要碳源類型。N-乙?；?D-葡萄胺、葡萄糖-1-磷酸鹽、L-天冬酰胺酸與α-環狀糊精在PC1 和PC2 上的載荷值均大于0.5，為最敏感的碳源。

表4 31種碳源的主成分載荷因子Table 4 Loading factors of principle components of 31 carbon sources

2.5 連作老參地土壤細菌群落結構豐度與多樣性

采用高通量測序分析生物質炭處理后土壤細菌群落結構變化，結果如表5所示。與新林土相比，老參地物種數(operational taxonomi unit, OTU)、豐度(ACE指數、Chao1指數)、多樣性(Shannon指數)均呈下降趨勢。采用生物質炭對老參地進行改良后上述指標均有所上升，其中Chao1指數與ACE指數增幅最大，平均增幅分別達到25.05%、19.10%，表明生物質炭處理有助于老參地土壤中細菌物種豐度及多樣性恢復，其中玉米秸稈炭及稻殼炭對上述指標影響較大。

2.6 連作老參地土壤細菌群落結構特征

分析不同土壤樣品中細菌群落結構門類比例變化(表6)，結果表明，新林土中優勢門類(占比>10%)為變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、疣微菌門4門，其OTUs 所占比例為 OTUs 總量的76.75%以上；老參地中優勢門類數量下降為2門，為變形菌門與放線菌門，其OTUs占比為65.39%，較新林土中二者占比增加了21.67個百分點；生物質炭處理后上述優勢門類比例(54.51%～65.39%)有所下降。其次，5個樣品中共檢測到27個細菌門，共有門類21個，新林土門類最豐富(26個)，與新林土相比，老參地土壤中3個細菌門消失(Fibrobacteres絲狀桿菌門，Elusimicrobia迷蹤菌門、Hydrogenedentes)，增加了1個細菌門(Fusobacteria梭桿菌門)。添加生物質炭后，僅稻殼炭處理下迷蹤菌門細菌數量有所恢復，其他消失細菌門類未檢測到OTU數據。

表5 不同處理下土壤細菌豐度與多樣性指數Table 5 Soil bacteria abundace and diversity indices of different treatments

與新林土相比，老參地中變形菌門、放線菌門、厚壁菌門、綠彎菌門、擬桿菌門、Candidatus Saccharibacteria、Parcubacteria、Candidate division WPS-2中OTUs增加(增加比例1.84%～1 348.88%)，增幅最大的為Candidatus Saccharibacteria、厚壁菌門；OTUs下降的門類包括酸桿菌門、疣微菌門、芽單胞菌門、浮霉菌門、Chlamydiae、Candidate division WPS-1、unclassified，下降比例45.10%～88.10%，降幅最大的為Candidate division WPS-1和疣微菌門。3種生物質炭對老參地土壤中變形菌門、疣微菌門、芽單胞菌門、厚壁菌門、Candidate division WPS-1、unclassified菌種豐度變化均具有調節作用，使其數量變化趨勢趨向于新林土。上述分析表明老參地土壤微生物群落出現種群單一化、單優勢種群上升的特點，而生物質炭對上述變化趨勢具有一定的調節作用。

表6 添加生物質炭對連作參地土壤細菌群落門類的影響Table 6 Effect of biochar treatment on bacterial community phylum changes of replanted ginseng soil

3 討論

3.1 生物質炭對人參產量及土壤理化性質的影響

根是人參主要的入藥部位，根重的累積量與Logistic增長曲線類似，一年至兩年生人參種苗的根重增加緩慢，優質兩年生人參種苗約為4～5 g[18]。有報道顯示采用老參地栽培重茬人參，參根的生物量累積速度會顯著下降，其單產僅為正茬人參的4.3%～14.2%[19-20]。本研究結果與之類似，老參地栽培的兩年生重茬人參病害高發，掉苗嚴重，剩余人參種苗生長受阻，參根均重僅為0.5 g，遠低于正茬優質種苗，表明老參地土壤不可直接用于人參重茬種植。將不同類型生物質炭用于老參地土壤修復后，兩年生重茬人參參根重量達到1.92～3.30 g，平均提升384.91%，說明生物質炭處理有助于提高重茬人參生物量。

土壤肥力是土壤的本質屬性，是保障藥用植物生產的根本，直接影響藥材的產量與品質。研究發現，野山參生長土壤的有機質、有效磷、有效鉀含量高，有利于増加土壤團聚體含量，提高植物抗病能力，滿足其多年生長對養分的需求[21]。隨著栽培年限增加，農田栽參土壤的有機質、全磷等礦質元素不斷下降，與野山參土壤肥力差異顯著[22]。研究認為土壤有機質與多種土壤指標間存在相關性，增加土壤有機質含量，可顯著提升人參產量并改善品質[23]，磷與人參總皂苷、根重、根徑均具有顯著的正相關關系[24]，二者是影響人參產量與品質的關鍵土壤因子，也是老參地土壤質量恢復的重要指標。本研究中，生物質炭處理穩定提升了土壤中有效磷與有機碳含量，二者增幅分別為47.04%～237.73%、8.09%～38.71%，表明生物質炭處理可能通過改善土壤中磷與有機碳的供給，提高參地土壤的供肥能力，從而促進人參生物量增加。而土壤中有效磷與有機質含量增加可能與生物質炭本身含有豐富的有機質及部分磷等養分元素有關[25-26]。也有研究認為在酸性土壤上增施有機物, 有機物分解產生的有機酸和其他螯合劑能將部分固定態的磷釋放為可溶態，從而增加土壤中有效磷含量，同時有機酸與磷酸根競爭固相表面專性吸附點位，減少了土壤對磷的吸附固定，也可促進人參對有效磷的吸收[27-28]。

3.2 生物質炭對土壤微生物代謝活性的影響

土壤微生物是土壤生態系統的重要組成部分，在反映土壤質量變化中起著重要的作用，其種類、數量與功能多樣性等受環境因子影響較大[29]。本研究顯示，增施生物質炭后老參地土壤微生物活性顯著增加，表明生物質炭可促進土壤微生物活性，這與高文翠等[30]的研究結果一致。原因可能與生物質炭含有的營養成分有關，施入土壤后可為微生物提供能量，促進微生物生長。研究認為，根區土壤微生物對氨基酸類、碳水化合物類、羧酸類、酚酸類、胺類等碳源的利用能力越強，土傳病害越輕[31]，說明增施生物質炭有利于提高老參地土壤的抗病性。

從六大類碳源利用情況看，老參地土壤微生物偏好碳源為聚合物類、羧酸類、氨基酸類，經生物質炭處理后土壤微生物表現為對聚合物類、酚酸類、氨基酸類碳源利用效率較高，其中以酚酸類物質為底物的功能微生物種群數量得到了顯著提升，這與生物質炭對連作棉田根際土壤微生物功能結構多樣性的影響結果類似[32]。有報道顯示，土壤微生物對酚酸類物質利用程度與水稻化感作用變化呈顯著正相關，誘導以酚酸類物質為碳源的微生物增加可提高水稻對稗草生長的抑制[33]。綜合上述分析，增施生物質炭可促進土壤微生物活性，提高土壤中酚酸類碳源利用率，有助于提高重茬人參的抗逆能力，從而保證人參的正常生長。

3.3 生物質炭對土壤微生物群落結構的影響

據目前的研究，隨人參連作年限增加，土壤中細菌數量呈減少趨勢，土壤由細菌型向真菌型轉變[34]。本研究采用高通量測序技術對比了新林土與老參地中細菌物種數量變化后也有類似發現，即老參地中物種數、豐度、多樣性均呈下降趨勢。采用3種不同生物質炭改良后上述指標均有所增加，表明生物質炭處理后老參地土壤細菌物種豐度及多樣性有所恢復。這可能與生物質炭的多孔結構有關，其豐富的孔隙可以為多種微生物提供棲息地和避難所，有助于微生物的生長和增殖[35]。

一般而言，在細菌門級分類水平上，革蘭氏陽性菌屬于寡養型細菌，通常在貧營養環境下占優勢(K-策略型)，革蘭氏陰性菌屬于富養型細菌，通常在富營養環境下生長旺盛(R-策略型)。本研究中新林土中優勢門類包括變形菌門、放線菌門、酸桿菌門、疣微菌門，其中變形菌門細菌為R-策略型，可以利用不穩定碳源迅速生長，其余3門細菌為K-策略型，主要利用難分解的碳源，如纖維素、半纖維素等[36]。經過人參栽培后，新林土逐漸轉化為老參地，土壤中變形菌門、放線菌門細菌數量增加，而酸桿菌門、疣微菌門細菌數量劇烈下降。研究認為老參地微生物群落的變化與人參根際分泌物的驅動密切相關[37-38]。人參根系分泌物中包括碳水化合物、氨基酸和有機酸等，可引發多種反應，參與塑造根際微生物組。其中某些特殊分泌物可直接吸引或排斥某類微生物，從而驅動根際微生物組的建成[39]。新鮮的有機分泌物中富含多種可溶性有機碳(dissolved organic carbon，DOC)，輸入到土壤中可以刺激變形菌門細菌的活性，產生激發效應而迅速增殖[40]。酸桿菌門是土壤微生物中的重要類群，多為嗜酸菌，適合在酸性環境中增殖，但生長速度較慢[41]。研究發現，未被擾動的森林土中酸桿菌門豐度最大，當土壤營養結構等發生變化時，生長較快的微生物將取代酸桿菌門，導致其豐度降低[42]。這也可能是老參地中酸桿菌門細菌數量降低的主要原因。疣微菌門可降解土壤中的頑固性有機物，有研究表明疣微菌門細菌豐度與土壤DOC 呈負相關[43]，也有研究認為疣微菌門細菌豐度下降與土壤中N過量有關[44]。采用生物質炭對老參地土壤進行改良發現，3種生物質炭對土壤細菌門級結構影響不同，但均對變形菌門、疣微菌門、芽單胞菌門、厚壁菌門等菌種豐度變化具有調節作用，使其數量變化趨勢趨向于新林土。本試驗中采用的3種生物質炭來源于3種不同的原料(玉米秸稈、稻殼、椰殼)，但制備成生物質炭后具有2個共同點，即pH值為堿性和含有大量有機質。其中大量難分解的有機碳施入土壤中后可以稀釋DOC，使變形菌門細菌數量增加趨勢減緩，同時刺激疣微菌門細菌生長。而芽單胞菌門豐度與土壤pH值呈正相關關系[45]，堿性的生物質炭加入土壤中可提高土壤pH值，有助于芽單胞菌門細菌數量的增加。

綜上所述，生物質炭可提升土壤有機質與有效磷含量，促進微生物對碳源的利用，增加土壤細菌豐度，調控細菌群落結構使其趨向于新林土的分布與比例，對老參地土壤體現出良好的修復、改良作用。但生物質對上述指標影響的程度、機理及指標的響應順序等問題還存在很多不確定性，究竟是由于生物質炭先改良了土壤環境，進而刺激了微生物多樣性，還是生物質炭首先刺激了對環境敏感的微生物活性，而后推動了土壤質量的持續改良[46]，亦或是二者同時進行，尚未有明確的結論，需要更多的研究加以說明。

4 結論

本研究結果表明，施用生物質炭可促進兩年生連作人參生物量與總皂苷含量增加，改善老參地土壤中速效磷與有機質的養分供應，提升土壤微生物代謝活性及對酚酸類碳源的利用程度。增施生物質炭后，老參地土壤細菌的物種豐度、多樣性指數與物種數量均呈趨向于新林土的變化趨勢。適量增施生物質炭有利于老參地土壤質量的調節與恢復。