周8425B衍生品種耐旱相關性狀的遺傳解析

于海飛，王麗娜，殷貴鴻，鄒少奎，李楠楠，張 倩，呂永軍，王雅美，韓玉林

(1.周口市農業科學院，河南周口 466000；2.中山大學農學院，廣東廣州 510275)

水資源短缺已成為威脅中國糧食生產安全的重要因素之一[1]。全球擁有近15億hm2耕地，近60%的糧食產量需要在灌溉條件較差的旱地產出[2]。近年來，隨著全球氣候變化加劇，干旱程度愈發嚴重，干旱周期加速，對全球糧食生產的威脅增大。小麥是中國重要的糧食作物之一，是中國北方人民的主食作物，受干旱脅迫影響極大。小麥全生育期需水量較大且生長季節降水量較少。近年來，由于氣候劇烈變化，中國小麥主產區地下水位大幅下降，嚴重威脅小麥生產安全[3]。發掘耐旱相關基因，培育耐旱品種，是保證小麥生產安全最為經濟、高效的途徑。

耐旱相關性狀是由多基因控制的復雜數量性狀，易受外界環境條件影響，遺傳機制復雜。基于基因型和表型的連鎖分析和關聯分析是挖掘數量性狀基因位點的兩種主要方式[4-6]。傳統的連鎖分析一般以雙親遺傳群體為材料，結果較為可靠，但需大量的人力和物力資源，且所有遺傳變異來源于雙親，無法反映出自然界廣泛存在的遺傳變異。全基因組關聯分析(genome-wide association analysis，GWAS)則可有效彌補連鎖分析的缺陷，其基于自然群體，可反映自然界廣泛存在的遺傳變異，且無需構建群體，有效降低人力和物力消耗，縮短研究時間。然而，GWAS一般需要密度較高且覆蓋度較廣的基因型數據。近年來，SNP芯片技術漸漸成為分子標記檢測的主流技術，并在水稻(44K)、玉米(50K和55K)及小麥(9K、90K、660K、15K和50K)等重要作物中廣泛應用[7-9]。基于SNP的GWAS已廣泛應用于小麥加工品質[10]、生理性狀[11]、抗病抗逆性[2,5-7]以及產量[5-6]等相關性狀基因的發掘研究。

黃淮麥區是中國重要的小麥產區，可提供全國近70%的小麥產量[12]。近年來，由于在育種工作中過于追求高產，黃淮麥區小麥品種多在高水肥條件下選育而成，生產上缺乏在干旱條件下耐旱性好、減產少且在水分充足條件下高產、不倒伏的水旱兼用型品種[3]。周8425B是黃淮麥區重要的骨干親本，具有優異的農藝性狀和較強的耐旱能力[13]，目前利用周8425B已育成100多個衍生品種(系)，且其后代具有較好的耐旱性。分析周8425B及其衍生品種的耐旱性，發掘其耐旱位點，開發相關的分子標記，可為黃淮麥區水旱兼用型品種分子輔助育種提供指導。本研究將周8425B及其68個衍生系品種連續2年2點種植，利用小麥50K SNP芯片對耐旱相關性狀進行GWAS分析，以期發掘耐旱相關性狀的基因位點，為耐旱品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為周8425B及其68份衍生品種，詳細信息見表1。

表1 供試品種名稱及其系譜信息

1.2 田間試驗和表型調查

周8425B及其衍生群體分別于2015-2016和2016-2017年度種植于周口市農業科學院試驗基地和鄭州滎陽試驗基地。周口試驗基地地下水埋深7 m以上，2015-2016和2016-2017年度份小麥生長季有效降雨量分別為238.7和256.4 mm；鄭州試驗基地下水埋深7 m以上，2015-2016和2016-2017年度小麥生長季有效降雨量為204.6和216.3 mm。為開展耐旱表型測定，試驗開展期間全生育期不人工灌水。采用完全隨機區組設計，3次重復。單個小區面積6 m2，行距20 cm，小區間距40 cm。肥料施用及病蟲害防治等田間管理措施同大田生產。

性狀調查主要包括苗期胚芽鞘長度、旗葉葉綠素含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量和耐旱指數[14-15]。調查方式如下：(1)苗期胚芽鞘長度：播種后第3 d開始，連續6 d于小區內長勢均勻區域測定30株幼苗的胚芽鞘長，取平均值作為該品種的胚芽鞘長度；(2)旗葉葉綠素含量：于花后7 和14 d，用手持式SPAD儀在每個小區內隨機選取10片旗葉測定旗葉葉綠素含量，取平均值作為該品種的葉綠素含量；(3)旗葉脯氨酸和可溶性含量：于花后7和14 d，于小區內隨機選取3片旗葉，利用液氮冷凍磨碎后稱取0.5 g放入試管中，利用酸性茚三酮法測定葉片內脯氨酸含量，利用蒽酮比色法測定葉片可溶性糖含量。(4)耐旱指數：耐旱指數=(旱地產量/正常灌溉產量)×(旱地產量/對照品種旱地產量的平均值)。

1.3 表型統計分析

利用Microsoft Excel 2019進行基本統計量分析；利用SAS V9.4進行性狀間表型相關分析、方差分析(Analysis of variance，ANOVA)和最佳線性無偏估計值(Best linear unbiased prediction，BLUP)值的計算。

1.4 SNP基因分型和群體結構分析

每個樣品選取5個材料的幼嫩葉片，混合取樣，采用CTAB法提取植株基因組DNA。由北京博奧晶典生物技術有限公司進行50K SNP芯片檢測，用GenomeStudio polyploid clustering v1.0軟件進行基因型分型。SNP質控標準為最小等位基因頻率(minor allele frequency,MAF)>5%且缺失率<20%[16]。經過濾后，共計36 686個SNP標記用于構建物理圖譜(未發表)。21條染色體平均標記密度為0.38 Mb，A、B和D染色體組平均標記密度分別為0.43、0.38和0.34 Mb。

選取2 000個在染色體上均勻分布的過濾后的SNP標記。用Admixture 1.3.0(http://dalexander.github.io/admixture/download.html)進行群體結構分析；用Tassel v5.0構建Neighbor-Jointing進化樹和進行主成分分析；用Tassel v5.0軟件中的Kinship模塊，采用Scaled_IBS方法計算親緣關系矩陣；用Tassel v5.0中的全矩陣(full matrix)和滑動窗口(sliding window)進行LD衰減分析，以第95百分位的r2值與LD衰減曲線的交叉點作為LD衰減距離。基于全基因組LD衰減距離，以8 Mb間隔來區別不同位點。

1.5 全基因組關聯分析

用Tassel v5.0軟件的混合線性模型(MLM，PCA+K)對耐旱相關性狀進行GWAS。以P≤0.001作為該標記與性狀顯著關聯閾值，R2表示解釋表型效應百分率。GWAS分析的QQ圖(quantile-quantile plot)和曼哈頓圖(manhattan plot)由R語言CMplot程序包(https://cran.r-project.org/web/packages/CMplot/)繪制。

2 結果與分析

2.1 耐旱相關性狀的表型

從表2可以看出，不同品種的胚芽鞘長度、耐旱指數以及旗葉可溶性糖、脯氨酸和葉綠素含量(花后7和14 d)均不同，且各性狀變化范圍較大。方差分析結果(表3)表明，基因型、環境及基因型與環境互作對周8425B衍生品種的胚芽鞘長度以及旗葉可溶性糖和脯氨酸含量(花后7 d和14 d)影響顯著，其中環境對胚芽鞘長度的影響最大。

表2 耐旱相關性狀的最佳線性無偏估計值

表3 耐旱相關性狀的方差分析(F值)

2.2 耐旱相關性狀GWAS分析

利用Tassel v5.0的MLM模型對耐旱相關性狀進行GWAS分析，結果表明，共檢測到252個顯著性SNP標記，分布于37個位點上(表4和圖1)。其中，檢測到29個與胚芽鞘長度顯著關聯的SNP標記，分布在3B、4B、5A、5D(2)和7D染色體上的6個位點內，可解釋8.8%～14.1%的表型變異。檢測到7個與花后7d旗葉脯氨酸含量顯著關聯的SNP標記，分布在1A、1B、5A和6D染色體的4個位點上，可解釋9.4%～15.8%的表型變異。檢測到5個與花后14 d脯氨酸含量旗葉顯著關聯的SNP標記，分布在2A、6D和7A染色體的3個位點上，可解釋8.7%～10.8%的表型變異。另外，檢測到32個與花后7 d旗葉葉綠素含量顯著關聯的SNP標記，分布在2B、5A和7D染色體的3個位點上，可解釋11.7%～13.1%的表型變異。檢測到30個與花后14 d旗葉葉綠素含量顯著關聯的SNP標記，分布在3A、6A(2)、6D和7B染色體的5個位點上，可解釋10.5%～13.1%的表型變異。檢測到124個與花后7 d旗葉可溶性糖含量顯著關聯的SNP標記，分布在1A、2D、3B、3D、4B、7A和7D(2)染色體的8個位點上，可解釋11.2%～18.8%的表型變異。檢測到20個與花后14 d旗葉可溶性糖含量顯著關聯的SNP標記，分布在3A(2)、3D和7D染色體的4個位點上，可解釋11.8%～13.8%的表型變異。檢測到5個與耐旱指數顯著關聯的SNP標記，分布在2D、3A和4A染色體的3個位點上，可解釋10.3%～12.5%的表型變異。

表4 耐旱相關性狀顯著相關的位點

圖1 耐旱相關性狀GWAS分析的曼哈頓圖

3 討 論

胚芽鞘的長度對幼苗耐旱性至關重要。Rebetzke等[17]研究報道，Rht1可調節胚芽鞘長度，可解釋27%～45%的表型變異，并在4BL染色體上定位到1個主效QTL，可解釋15%～27%的表型變異，與本研究在4B染色體上檢測到的AX_109316633距離較近，可能為相同位點。Zhang等[18]分別在3B和5D染色體上檢測到與胚芽鞘長度相關的位點，基于物理圖譜和多標記公共圖譜比較，發現這兩個位點與本研究在3B(AX_94421831)和5D(AX_110637256)染色體上檢測的位點位置接近，可能是同一個位點。Li等[19]在1BS、2DS、4BS和5BL上檢測到4個與胚芽鞘長度相關的位點，但這些位點均與本研究檢測到的位點位置不同。推測本研究在5A(AX_95659260)、5D(AX_109714016)和7D(AX_109147840)染色體上檢測到的3個位點可能是新的胚芽鞘長度相關位點。

植株可溶性糖含量是耐旱性強弱的重要指標。Galiba等[20]利用中國春染色體代換系在5A染色體上發掘到一個控制可溶性糖含量的位點，與本研究檢測到的位點位置均不同。Rebetzke等[21]利用3個RIL群體對莖稈可溶性糖含量進行QTL定位，在1A、1B、2B、2D、4B、7A和7B染色體上檢測到多個QTL，基于物理圖譜和多標記公共圖譜比較，發現與本研究在1A(AX_111561001)、2D(AX_110089653)和7A(AX_110576624)染色體上檢測到的位點位置接近或一致。Salem等[22]利用含有114個株系的RIL群體對可溶性糖含量(花后14 d)進行QTL定位，在2D、5D和7D染色體上定位到3個QTL，可解釋表型變異的21.0%～42.2%，其中7D染色體上的位點與本研究檢測到的AX_111496932位點位置接近。Yang等[23]利用一個含有150個株系的DH群體對莖稈可溶性糖含量進行QTL定位，發現位于3A和3B染色體上的位點與本研究在3A(AX_110454039)和3B(AX_109294391)染色體上檢測到的位點位置接近。Zhang等[18]利用262個品種和209個SSR標記對小麥植株、葉片和莖稈可溶性糖含量及用于呼吸和運轉的可溶性糖含量進行GWAS，分別檢測到13、13、23和14個顯著位點，與本研究檢測到的位點位置均不同。Dong等[10]利用豆麥/石4185群體將莖稈可溶性糖含量基因TaSST-D1定位在7DS染色體上，可解釋8.8%～11.3%的表型變異，與本研究在7D染色體上檢測到的AX_110575353位點位置接近。此外，Dong等[10]還利用166份黃淮麥區小麥品種進行90 K SNP檢測并開展莖稈可溶性糖含量關聯分析，檢測到52個顯著關聯標記，位于23個位點上。其中，11個標記在2個或以上環境中被檢測到，這些位點與本研究所檢測到的位點位置均不同。綜上，3D(AX_110123800)、4B(AX_108778380)、7D(AX_94958668)、3A(AX_111470358)和3D(AX_111922285)這5個位點均可能為新的可溶性糖含量相關位點。

迄今為止，脯氨酸含量依然是較為復雜的表型性狀，遺傳機制尚不明晰，對旗葉脯氨酸含量進行QTL定位的報道較少。楊 凱等[24]利用中國春-Hope代換系和中國春-長穗偃麥草代換系，認為在4B、5A和5D染色體上可能有控制干旱脅迫下脯氨酸累積的基因存在，在6B和6D染色體上可能有抑制脯氨酸積累的基因存在。此外，Sayed等[25]利用大麥BC2DH群體進行干旱脅迫處理，對脯氨酸含量進行QTL定位，在3H、4H、5H和6H染色體上定位到4個QTL，可解釋4.0%～6.1%的表型變異。本研究檢測到的脯氨酸含量位點，除5A染色體上的AX_94530985位點與楊 凱等[24]等檢測到的位點位置接近外，其他位點均可能為新的位點。

葉綠素是葉片進行光合作用最重要的色素，可直接反映品種在不同時期和干旱脅迫下的耐旱能力。對旗葉葉綠素含量進行基因定位已有大量報道。Zhang等[26]利用小麥DH群體，共檢測到17個與旗葉葉綠素含量相關的QTL，其中10個位點在2個或以上環境中被檢測到，位于3A和7B染色體的位點分別與本研究檢測到的3A(AX_110483079)和7B(AX_109461447)位點位置接近。Sukumaran等[27]在兩種灌溉條件下進行產量和生理性狀的關聯分析，在3B(Kukri_c48750_1372)和6A(wsnp_Ex_c11348_18326787)染色體上檢測到2個與灌漿期旗葉葉綠素含量顯著相關的位點，其中6A染色體上的位點與本研究在6A染色體上檢測到的AX_109981766位點位置接近。Gao等[28]利用90K SNP芯片對含有246個株系的RIL群體的產量及生理性狀進行QTL定位，檢測到10個與開花期旗葉葉綠素含量相關的QTL，檢測到8個與花后10 d旗葉葉綠素含量相關的QTL，其中5AL染色體上的位點與本研究檢測到的AX_109860622位點位置接近，可能為同一位點。Shi等[29]、Xu等[30]和Bhusal等[31]分別檢測到28、2和17個與旗葉葉綠素含量相關的位點，經比對發現，這些位點與本研究檢測到的位點位置均不同。綜上，2B(AX_110906386)、7D(AX_109240909)、6A(AX_108754874)和6D(AX_110827708)這4個位點可能為新的葉綠色含量相關位點。

前人對耐旱指數遺傳機制也有研究。Kirigwi等[32]在不同灌溉條件下對耐旱指數進行QTL定位，檢測到3個耐旱指數QTL，與本研究在4A染色體上檢測到的AX_110441266位點位置接近。Kadam等[33]在4BS染色體上定位到一個主效耐旱指數QTL。Shukla等[34]利用包含206個株系的RIL群體并結合173個SSR標記，在3B(2)和4A染色體上檢測到3個耐旱指數QTL，可解釋12.7%～15.6%的表型變異。其中，4A染色體上的主效QTL在絕大多數環境下均可被檢測到，以上檢測位點與本研究所檢測到的耐旱指數相關位點位置均不同，推測本研究在2D和3A染色體上檢測到的3個位點均可能為新的耐旱指數相關位點。

小麥耐旱遺傳機制十分復雜。研究品種間耐旱特性差異，篩選耐旱品種，對培育新的優良品種具有重要價值。本研究在68份周8425B衍生系品種中檢測到37個與耐旱顯著關聯的位點。其中，16個位點與前人發現的耐旱相關位點位置部分重疊或一致，這些位點更為可靠，可進一步轉化為KASP或STARP標記，用于分子輔助育種和QTL精細定位。21個新的遺傳位點可進一步驗證其可靠性，并開展后續遺傳研究。在周8425B衍生品種中，周麥16、矮抗58、鄭農21、淮麥28、周麥21、鄭麥379、瀏虎98和偃展4110共8份品種具有較好的耐旱性，且含有較多優異等位基因，可作為親本用以提升育種材料的耐旱性。基于以上結果，下一步研究工作將主要集中于關聯位點的驗證以及可用SNP標記的開發，為提升小麥品種耐旱性提供參考。